草莓根腐病病原菌分離與鑒定

鳳舞劍，朱 強，白耀博，曹 丹，陶佩琳

（1.徐州生物工程職業技術學院/徐州市現代農業生物技術重點實驗室，江蘇 徐州 221006；2.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222005）

草莓因種植周期短、見效快、收益高，而被廣泛種植，同時也深受消費者喜歡。江蘇作為草莓發展重點省份，種植規模與產量均居全國前列[1]，尤其是近幾年來江蘇各地著力發展草莓產業，主要以鎮江市句容市、連云港市東海縣、徐州市賈汪區及銅山區等為中心，打造出多個草莓特色小鎮，如徐州市賈汪區耿集鎮“莓好田園”現代農業生態小鎮、徐州市銅山臺上草莓特色小鎮等[2]。徐州地區草莓生產規模已達2.3萬hm2，栽培模式主要以保護地為主，因連作時間長、管理粗放，導致土傳病害嚴重，主要表現在草莓苗定植后根腐病大發生，導致大面積缺苗或斷壟，給種植戶生產帶來較大的損失，嚴重阻礙了草莓產業的發展。目前，草莓根腐病致病菌種類多且分布廣，徐州地區草莓根腐病致病菌病原尚未有報道。因此，篩選、分離及鑒定徐州地區根腐病病原菌種類，為預防草莓根腐病的防控提供科學的依據，對于指導當地草莓生產實踐、推動草莓產業綠色防控具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集

樣本采集于江蘇省徐州市徐州安耕現代農業科技示范園草莓種植基地，經徐州市現代農業生物技術重點實驗室李文紅教授鑒定其為典型根腐病病株。

1.2 病原菌的分離與純化

取典型病株切取根部，用自來水反復沖洗至潔凈無雜質，將病變組織切成1 cm×1 cm塊狀。用無菌鑷夾取病塊組織置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用無菌水沖洗干凈，放置于0.1%氯化汞溶液中浸泡2 min，取出后用無菌水沖洗干凈，然后用無菌紗布擦拭掉水分。用無菌解剖刀將病組織塊切成5 mm×5 mm規格，放于PDA培養基上在恒溫25 ℃室內暗條件下培養5 d[3]。自菌落邊緣挑取不同形態菌絲進行分離培養[4]，純化后于恒溫箱中保存。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 病原菌形態學鑒定

采用平板扦片法[5]。將菌株XZ-D01置于PDA培養基上并進行25 ℃恒溫培養，在菌絲生長初期插入已滅菌的蓋玻片，5 d后菌絲延伸至蓋玻片上，用乳酸石炭酸棉藍染色液染色后挑取菌絲并制作水浸片，用顯微鏡觀察菌絲生長情況及其形態特征。

1.3.2 病原菌分子生物學鑒定

挑取病原體，經培養后提取DNA[6]再進行PCR擴增，獲取產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測定堿基序列，將獲得的序列存儲于NCBI網站并提交至GenBank數據庫，采用BLAST軟件，比對病原菌堿基序列與其他草莓根腐病病原菌堿基序列同源性[7]，最后借助MEGA 7.0軟件構建rDNA-ITS序列系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 草莓根腐病病原菌的分離

采用組織分離法，從徐州市賈汪區“莓好田園”現代農業產業園草莓生產基地根腐病害植株（圖1-a、圖1-b）上共分離出細菌4株（圖1-c），真菌11株（圖1-d）；其中，5株真菌表達出典型的根腐病病原菌致病特征，分別命名為CMGF-1、CMGF-2、CMGF-3、CMGF-4、CMGF-5。

圖1 草莓根腐病病株及病原菌的分離

2.2 草莓根腐病病原菌的鑒定

2.2.1 菌落形態學鑒定

由圖2可知，菌株CMGF-1—GMGF-5中有3株產菌核，3株產色素，5株初生菌絲均為白色，生長迅速（5 d可鋪滿平板）；5株氣生菌絲發達，空間伸展力強；其中，CMGF-4生長速度最快，氣生菌絲呈絲絨狀；3株菌落輻射呈環狀，2株菌落邊緣呈不規則狀，詳述如表1，CMGF-1：邊緣整齊，有白色、發達的氣生菌絲，產黑色菌核，不產色素，呈環狀輻射；CMGF-2：邊緣參差不齊，氣生菌絲發達且顯白色，產黑色菌核，產黃色素，外緣生菌絲呈黃色，內緣生菌絲呈白色，無輻射狀；CMGF-3：邊緣參差不齊，氣生菌絲發達且呈白色，產黃色素，無輻射狀；CMGF-4：邊緣齊整，氣生菌絲發達且呈白色，產黑紫色素，不產菌核，呈環狀輻射；CMGF-5：邊緣整齊，氣生菌絲發達呈白色，不產色素且無菌核，呈環狀輻射。

表1 菌落形態

圖2 CMGF-1—CMGF-5菌落形態學特征（5 d）

2.2.2 微觀形態學鑒定

由圖3可知：CMGF-1是無隔膜、無顏色的氣生菌絲，分生孢子梗直立，產孢于分生孢子座上，分生孢子短桿狀，無隔膜，脫落孢子盤呈簇狀。

圖3 CMGF-1微觀形態觀察（40×10倍）

由圖4可知：CMGF-2和CMGF-3是細長、彎曲的氣生菌絲，有隔膜，隔膜處有縊縮，產生紡錘形分生孢子，頂端無附屬絲，脫落后可見葡萄狀孢子盤。這2個菌株微觀形態極其相似，比對圖2菌落形態學特征，可判定其為同屬，是否為同種尚需進一步研究。

圖4 CMGF-2和CMGF-3微觀形態觀察（40×10倍）

由圖5可知：CMGF-4細長筆直的氣生菌絲無隔膜，產球狀分生孢子，單梗產圓鈍形孢子，分布于兩側，釋放后呈較為典型鐮刀狀。依據《真菌鑒定手冊》[8]可初步診斷為串珠鐮刀菌。

圖5 CMGF-4微觀形態觀察（40×10倍）

由圖6可知：CMGF-5直而長的氣生菌絲無隔膜，單梗產圓鈍孢子，釋放后孢子細長且兩端尖銳，呈鐮刀狀。依據《真菌鑒定手冊》[8]可初步診斷為尖孢鐮刀菌。

圖6 CMGF-5微觀形態觀察（40×10倍）

2.2.3 分子生物學鑒定

由圖7可知：CMGF-1與K C010547.1Colletotrichum gloeosporioides在進化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-1為膠孢炭疽菌，近緣性為58%。

圖7 CMGF-1系統進化樹

由圖8可知：CMGF-2與K Y_606543.1Neopestalotiopsis clavispora在進化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-2為棒孢擬盤多毛孢，近緣性高達87%。

圖8 CMGF-2系統進化樹

由圖9可知：CMGF-3與K R_052094.1Neopestalotiopsis clavispora在進化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-3為棒孢擬盤多毛孢，近緣性為58%。圖8和圖9系統進化樹進一步驗證了CMGF-2和CMGF-3菌株的近緣性，可推斷出這2個菌株屬于同種的2個亞種。

圖9 CMGF-3系統進化樹

由圖10可知：CMGF-4與NR_159818.1Fusarium continuum在進化樹中最近緣，可鑒別為同種，則CMGF-4為串珠鐮刀菌，近緣性達91%，進一步驗證了2.2.2形態學鑒定的結論。

圖10 菌株CMGF-4系統進化樹

CMGF-5的分子生物學鑒定結果同CMGF-4。

3 結論與討論

本研究采用組織分離法，從江蘇省徐州市賈汪區“莓好田園”現代農業產業園草莓生產基地取樣，通過分離、純化，從大量感病植株病原菌落中獲取了5個真菌菌株，經形態學甄別與分子生物學堿基序列測定，鑒定結論是：CMGF-1是膠孢炭疽菌或其亞種，CMGF-2、CMGF-3是棒孢擬盤多毛孢或其亞種，CMGF-4是串珠鐮刀菌或其亞種，CMGF-5是尖孢鐮刀菌或其亞種。徐州地區草莓根腐病病原菌是由多種病原菌長期適應連作生境而進化的結果。目前國內草莓根腐病致病菌多達20種[9-15]，癥狀表達具有多樣化。從徐州地區草莓根腐癥狀表達上來看，草莓黑根根腐致病菌是鐮刀菌和擬盤多毛孢菌，此類發病率高、危害重；其次，草莓紅中柱根腐致病菌是病原菌膠孢炭疽菌。不同的區位環境可能會導致病原菌的基因構型及致病力差異化，基于rDNA-ITS序列分析低緣性關系與此是否具有相關性，尚需進一步研究。