蒿秦化斑方對紫外線損傷角質形成細胞黏附分子及PI3K/AKTAKT/GSK-3β通路的影響

王思藝 孫麗蘊

摘要 目的：觀察蒿秦化斑方對HaCat細胞紫外線B（UVB）急性損傷模型細胞黏附分子及PI3K/AKT/GSK-3β通路的影響，探討該方治療光敏感性皮膚病的作用機制。方法：采用300 mJ/cm2 UVB建立HaCat細胞急性光損傷模型，使用不同劑量蒿秦化斑方干預，分為空白對照組、UVB模型組、及蒿秦化斑方高、中、低劑量組。采用RT-PCR法檢測細胞黏附分子ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相對表達量，采用蛋白質免疫印跡法分析PI3K/AKT/GSK-3β通路相關節點p-AKT（Ser-473）、p-AKT（Thr-308）、GSK-3β、PI3K相對表達量。結果：UVB急性光損傷可有效減少HaCat細胞ICAM-1的表達（P<0.01），對VCAM-1及ELAM-1表達影響不顯著;蒿秦化斑方高劑量組能有效抑制HaCat細胞3種細胞黏附分子的表達（P<0.05）;蒿秦化斑方中劑量組能有效抑制HaCat細胞內皮細胞白細胞黏附分子-1（ELAM-1）及血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）的表達（P<0.01）。UVB急性光損傷對HaCat細胞AKT磷酸化、PI3K表達影響不顯著，蒿秦化斑方低劑量處理對HaCat細胞AKT磷酸化具有促進作用（P<0.05）。UVB急性光損傷使HaCat細胞糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達水平升高（P<0.01），蒿秦化斑方高、中、低劑量處理均對HaCat細胞GSK-3β表達水平有所抑制（P<0.01）。結論：蒿秦化斑方能降低由UVB急性損傷造成的HaCat細胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達進而緩解局部炎癥和遲發型超敏反應的發生，并且能夠激活HaCat細胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的急性光損傷中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎癥反應的作用。

關鍵詞 光敏感性皮膚病;蒿秦化斑方;蛋白激酶B;糖原合成酶激酶-3β;細胞黏附分子;人永生化角質形成細胞;紫外線B;紫外線損傷

Abstract Objective：To observe the effects of Haoqin-Huaban on the relative adhesion factors and the PI3K/AKT/GSK-3β pathway of an acute UVB light HaCat-cell injury model in order to further explore the mechanism of the treatment for photosensitive skin disorders.Methods：UVB light（300 mJ/cm2） was used to establish an acute light HaCat-cell injury model.The intervention was performed by using Haoqin-Huaban in various concentrations.The groups were divided into：a blank control group（C）; an UVB model group（M）; a high Haoqin-Huaban dosage group（G）; medium Haoqin-Huaban dosage group（Z）; low Haoqin-Huaban dosage group（D）.Real-time PCR was conducted to detect the relative expressions of 3 cell adhesion molecules（CAMs），i.e.，ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1.Western Blotting was implemented to analyze the relative expressions of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β，and PI3K，which were all related nodes of the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Western Blot method was used to analyze the relative expression of p-AKT（Ser-473），p-AKT（Thr-308），GSK-3β and PI3K related nodes in the PI3K/AKT/GSK-3β pathway.Results：UVB acute light injury reduced ICAM-1 expression in the HaCat cell model and had no significant effect on the expressions of VCAM-1 and ELAM-1（P<0.01）.The expressions of the three CAMs in the HaCat cell model were effectively inhibited in the G group（P<0.05），while those of ELAM-1 and VCAM-1 were considerably impeded in the Z group（P<0.01）.It was also found that acute UVB light injury had no significant effect on AKT phosphorylation and PI3K expression in the HaCat cell model.The low-concentration treatment of Haoqin Huaban Forumla can promote the phosphorylation of AKT in HaCat cells（P<0.05）.Acute UVB light damage increased the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.The high，medium and low concentration treatments of Haoqin Huaban Formula inhibited the GSK-3β expression level of HaCat cells（P<0.01）.Conclusion：Haoqin-Huaban Formula can reduce the expression of adhesion molecules such as ICAM-1，ELAM-1 and VCAM-1 in HaCat cells caused by acute UVB damage，thereby alleviating the occurrence of local inflammation and delayed-type hypersensitivity，and can activate HaCat cells PI3K/AKT/GSK-3β pathway and plays a role in anti-oxidation，anti-apoptosis and reducing inflammation in the acute light damage caused by UVB.

Keywords Photosensitive skin disease; Haoqin-Huaban Formula; AKT; GSK-3β; Cell adhesion molecule; HaCat cells; Ultraviolet B; Ultraviolet injury

中圖分類號：R289.5;R275.9文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.012

光敏感性皮膚病是由紫外線照射造成皮膚多種病理反應的一系列疾病，其包括急性光損傷、慢性光老化、光變態反應（如多形性日光疹）等，甚至能夠誘發皮膚腫瘤，其臨床表現通常以日光暴露部位出現紅斑、水腫及多形性皮損，患者自覺灼熱瘙癢為主[1]。蒿秦化斑方，是在皮外科名老中醫趙炳南“光毒郁膚”理論基礎下創立而來，以“清熱、解毒、涼血”為法，在治療光敏感性皮膚病方面具有較好療效。研究發現，蒿秦化斑方具有增強細胞活性、抗氧化、調節炎癥介質表達的作用。光敏感性皮膚病在臨床中的主要表現為組織學上的炎癥和表皮細胞的病理變化，皮膚的炎癥性損害往往依賴于各種細胞的相互作用，有研究顯示紫外線造成的皮膚局部超敏反應可能與細胞黏附分子的表達相關，細胞黏附分子的表達能夠誘導皮膚炎癥介質的產生和免疫細胞的浸潤，從而產生局部炎癥和皮膚濕疹樣改變[2]。除此之外，既往研究顯示PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活具有抑制氧化應激、促進增殖、抗凋亡、抑制炎癥反應等作用[3-4]，這與紫外線輻射誘發的光敏感性皮膚病的發病機制較為一致。本研究以人永生化角質形成細胞（Human Skin Keratinocytes，HaCat）為研究對象，探索蒿秦化斑方緩解紫外線B（Ultraviolet B，UVB）損傷的潛在機制，以證明蒿秦化斑方保護HaCat細胞免受UVB輻射損傷的功效。探究了HaCat細胞相關黏附分子，細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、內皮細胞白細胞黏附分子-1（ELAM-1），以及PI3K/AKT/GSK-3β通路相關靶點，肌酸肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的影響，進一步探討該方治療光敏感性皮膚病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與培養 HaCat細胞由中國中醫科學院（編號：3111C0001CCC000373）提供，HaCat細胞在1460培養基中加入10%牛胎血清，在37 ℃，5%二氧化碳劑量的濕化培養箱中培養，直至細胞密度大于80%，以胰酶（0.25%）消化后進行后續試驗。

1.1.2 藥物 蒿秦化斑方組方與劑量均按照《中華人民共和國藥典》（2015年版）規定執行，方劑組成：青蒿30 g、龍膽草10 g、水牛角15 g、生地黃15 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防風15 g、生甘草6 g。實驗藥物由北京中醫醫院飲片藥房提供（盛世隆藥業有限公司）提供。參照前期課題實驗方法制備實驗用藥液[5]，高劑量中藥為最大無毒劑量C（C=12.1 mg/L）、中劑量中藥為2/C、低劑量中藥為4/C。

1.1.3 主要試劑與儀器 RIPA總蛋白提取試劑盒（Sigma，美國，貨號：R0278）;BCA蛋白定量試劑盒（Sigma，美國，貨號：BCA1）;NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit（Thermo，美國，貨號：NP0050）;NuPAGE Transfer Buffer（20X）（Thermo，美國，貨號：NP0061）;TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP405-02）;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本，貨號：RR047B）;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ ROX plus（TaKaRa，日本，貨號：RR82LR）;DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本，貨號：3427Q）。

二氧化碳培養箱（SANYO，日本，型號：MCO-15AC）;分光光度計（Therno scientific，美國，型號：NANODROP 2000）;酶標儀（Therno scientific，美國，型號：MultiSkan3）;電泳儀（Therno scientific，美國，型號：Mini Ge Tank）;轉膜儀（Therno scientific，美國，型號：Mini Blot Module）;凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，型號：Tanon 1600）;熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國，型號：ABI7500）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理 將上述細胞隨機分為空白對照組、模型組、蒿秦化斑方高、中、低劑量組5組，空白對照組不進行任何處理。其余各組置于UVB燈下給予單次劑量300 mJ/cm2的UVB輻射，UVB光照使用UV236照射系統（Waldmann Medizintechnik，Villingen-Schwenningen，德國）進行照射，使用經過校準的光度計（Waldmann）計量照射強度。UVB照射15 min后蒿秦化斑方高、中、低劑量組分別加入12.1 mg/mL（C）、6.05 mg/mL（2/C）、3.25 mg/mL（4/C）劑量中藥，作用24 h。

1.2.2 RT-PCR檢測 根據產品說明，使用TRNzol總RNA提取試劑盒對各組細胞進行總RNA提取，使用NanoDrop ND-2000進行RNA純度鑒定，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser進行反轉錄，然后按說明進行Real Time-PCR檢測，每組進行3孔重復，以測量RNA表達。用2-△△Ct方法計算RNA水平，并標準化為GAPDH，實驗使用引物序列。見表1。

1.2.3 蛋白質免疫印跡法分析 使用補充有蛋白酶抑制劑的細胞RIPA裂解緩沖液提取細胞中的蛋白質。使用Bradford方法，用BCA蛋白定量試劑盒測量蛋白質表達水平。通過電泳分離總蛋白質，然后轉移到NC膜上，將NC膜用5%脫脂奶粉-TBS在37 ℃下封閉半小時，然后在4 ℃下與一抗孵育過夜。一抗包括：抗PI3K抗體（1∶1 000），抗p-AKT抗體（308）（1∶1 000），抗p-AKT抗體（473）（1∶2 000），抗mTOR抗體（1∶500）GSK-3β抗體（1∶1 000）。溫育后，每次用TBST沖洗NC膜5次，每次約3 min，以除去過量的單克隆溶液.然后用二抗孵育，用5%脫脂奶粉-TBS稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L），HRP（1∶20 000），孵育40 min。內參蛋白組以Stripping Buffer、去離子水、TBST洗膜，將NC膜用5%脫脂奶粉-TBS在37 ℃下封閉半小時，加GAPDH鼠單抗（1∶10 000），溫育40 min;用5%脫脂奶粉-TBS稀釋二抗，山羊抗鼠IgG（H+L），HRP（1∶10 000），孵育40 min。之后進行TBST洗膜并與ECL反應，并對進行膠片曝光顯影，2 min后定影，對影像進行相對灰度分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據分析，其中計量資料以均數±標準差（±s）表示，3組及以上組間差異采用單因素方差分析以及Tukey檢驗分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞黏附分子相對表達水平 在HaCat細胞UVB急性光損傷實驗中，與空白組比較，經UVB照射處理與中藥高劑量組處理的HaCat細胞ICAM-1相對表達量顯著降低（P<0.01），中、低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細胞ICAM-1表達量較模型組有所回升（P<0.01）;高、中劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細胞ELAM-1與VCAM-1表達量均顯著降低（P<0.05）。見表2。

2.2 各組PI3K/AKT/GSK-3β通路標志物相對表達水平 在HaCat細胞UVB急性光損傷實驗中，與空白組比較，經UVB照射處理的HaCat細胞p-AKT（Thr-308）表達顯著降低（P<0.01），GSK-3β表達顯著增高（P<0.01）;與模型組比較低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細胞p-AKT（Thr-308）表達量有所回升（P<0.05），與模型組比較高、中、低劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細胞GSK-3β表達量有所下降（P<0.01）;此外與模型組比較中劑量蒿秦化斑方處理的HaCat細胞PI3K表達量有所下降（P<0.01）。見表3。

3 討論

蒿秦化斑方是在皮科知名專家趙炳南教授驗方的基礎上逐漸完善而成，以“光毒郁膚”為理論基礎，以清熱涼血解毒為主要原則。方中以青蒿為君藥，青蒿善解常夏之暑熱，清中有透散之力，可引邪外出，宣化濕熱，使血分伏熱外透而出。方中水牛角、生地黃、秦艽共為臣藥，水牛角咸寒，清熱解毒，專入血分，平熱降火;生地黃味甘苦寒，協水牛角行清熱涼血化斑、滋陰生津之效，秦艽能驅一身之風，祛風除濕，清熱利尿，利濕與泄熱并進，瘀熱得去，濕濁自退。方中牡丹皮、赤芍、防風為佐藥，共擔清熱涼血，活血散瘀，化斑之功效，牡丹皮味苦性辛微寒入心、肝腎經，善清血中伏熱，且活血散瘀之力亦佳，赤芍清熱涼血、散瘀消腫，能使血流暢而不流瘀，防風祛風解表止癢，牡丹皮治風熱在膚瘙癢劇烈者。此外在現代藥理學的研究中蒿秦化斑方中藥味也多有抗氧化、抗炎、調節免疫的作用，青蒿主要有效成分為青蒿素，相關衍生物為青蒿琥酯等，研究顯示，青蒿及其衍生物具有抑制IL-6、IL-10、TNF-α等炎癥介質表達，對T細胞相關皮膚超敏反應具有一定的抑制作用[6]。生地黃有效成分梓醇能夠抑制細胞黏附分子的表達，并且可以抑制核因子κB以及IL-β、IL-6、TNF-α等炎癥介質的表達[7]。牡丹皮中有效成分丹皮酚具有較好的抗氧化能力，同時能夠抑制炎癥介質表達，并具有抗細胞凋亡的作用[8-9]。赤芍的有效成分中包含較多黃酮類及苷類化合物，可減少細胞氧化物質的產生，并且能夠降低細胞炎癥介質如TNF-α和IL-6的水平[10-11]。防風的色原酮、多糖及揮發油均有較強的抗氧化作用，且能通過核因子κB信號通路、MAPK信號通路發揮抗炎作用[12-13]。有實驗證明甘草提取物甘草酸能夠通過抑制炎癥介質的表達和抗氧化從而減緩HaCat細胞光老化效應，并且能夠抑制凋亡執行蛋白的表達以達到抑制細胞凋亡的作用[14]。

前期研究發現，蒿秦化斑方能夠抑制細胞凋亡增加細胞增殖活性，并且能夠增加SOD、CAT的表達，減少MDA的表達從而抑制UVB誘導的HaCat細胞氧化損傷，并且可以降低HaCat細胞中IL-10的表達提高TGF-β的表達抑制UVB誘導的HaCat細胞炎癥反應，可以初步推測蒿秦化斑方具有抑制氧化應激，下調炎癥介質的表達，修復細胞屏障功能[5]。

細胞黏附分子是一類調節細胞與細胞外基質相互結合且起黏附作用的膜表面糖蛋白[15-17]，廣泛參與炎癥免疫反應，在皮膚科領域，細胞黏附分子與銀屑病、特應性皮炎、慢性蕁麻疹、紅斑狼瘡均有較為密切的病理關系，細胞黏附分子的高表達常在一些炎癥性皮膚疾病、遲發型超敏反應，感染性皮膚疾病中出現，在這些疾病過程中細胞黏附分子可促進趨化因子和炎癥介質的釋放，增強免疫細胞的黏附作用，促進免疫細胞向炎癥部位浸潤，從而促進炎癥的發生與發展。在光敏感性皮膚疾病中，已有研究證明多形日光疹發病可能與細胞黏附分子介導的免疫反應有關，紫外線誘導多形日光疹皮損與細胞黏附分子ELAM-1、ICAM-1、VCAM-1的表達密切相關，VCAM-1和ELAM-1促進免疫細胞在內皮細胞上的黏附，多形日光疹的局部炎癥反應時效應T細胞通過表達相關細胞因子或受體配相互體作用使細胞黏附分子表達于內皮細胞上，從而促使具有互補表面受體結構的白細胞向局部炎癥部位浸潤，其黏附分子誘導局部炎癥的方式與皮膚遲發型超敏反應類似[18]。多形日光疹患者皮損部位細胞黏附分子及抗原提呈細胞表面表達力提高，黏附分子是參與多形日光疹發病機制的一類重要分子[19]。在本實驗中通過UVB照射建立HaCat急性光損傷模型，結果顯示與紫外線誘導的遲發性超敏反應不同，在HaCat急性光損傷的情況下對細胞黏附分子的表達影響較小，只有ICAM-1的表達有所減低，結合團隊前期試驗結果考慮，這可能與急性光損傷所引起的細胞凋亡有關，但通過與空白組對比蒿秦化斑方高劑量組能夠有效降低ICAM-1、ELAM-1及VCAM-1 3種細胞黏附分子的表達;蒿秦化斑方中劑量組能夠較為有效地抑制ELAM-1以及VCAM-1的表達，可見蒿秦化斑方對HaCat細胞UVB急性光損傷模型ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1相關炎癥反應具有一定的調節作用，可以推測蒿秦化斑方可能通過降低HaCat細胞黏附分子的表達，進而減少相關炎癥介質表達和嗜酸性粒細胞等其他免疫細胞的浸潤，從而具有一定抑制局部皮膚炎癥的作用，且更可能對紫外線誘發的遲發型超敏反應具有干預效果。

GSK-3β參與多種信號通路的調控，包括代謝、分化和免疫，以及細胞的凋亡和成活[20]。GSK-3β在底物識別和激酶活性調節方面具有獨特的特點，其具有大量的磷酸化靶點，因此其廣泛的參與到多種細胞生物過程的調控當中。如GSK-3β活性受PI3K/AKT信號的抑制，相反當PI3K/AKT通路失活時，GSK-3β表現出促凋亡的作用，而當PI3K在質膜上被募集，其經過相關細胞膜脂質的相關磷酸化后促進了AKT的募集以及磷酸化，AKT在氨基酸殘基T308和S473上的磷酸化激活后，會在其N端磷酸化GSK-3β，這導致GSK-3β的失活，有研究顯示PI3K/AKT通路的激活可使GSK-3β的活性降低40%～50%，進而與Bcl-2等抗凋亡蛋白協同體現抗細胞凋亡的作用。除此之外GSK-3β還是免疫系統許多組分的調節要素[21]，GSK-3β對于TLR的激活在細胞炎癥介質的產生中至關重要，研究顯示抑制GSK-3β的活性能夠有效抑制細胞炎癥介質如IL-6、IL-8、TNF的表達，并且能夠抑制Wnt信號轉導以降低免疫細胞的募集作用，同時抑制GSK-3β還能夠還可以提高Treg的表達以及成活以抑制炎癥的發生。另研究指出激活PI3K/AKT/GSK-3β通路提高磷酸化GSK-3β的水平，可以通過抑制細胞NOX和iNOS的表達而表現出抗氧化活性[3]。在本實驗中，UVB處理對HaCat細胞AKT Thr-308位點磷酸化具有一定的抑制作用，蒿秦化斑方低劑量處理對HaCat細胞AKT Thr-308位點磷酸化具有促進作用，HaCat細胞GSK-3β表達會因UVB輻射而增加，蒿秦化斑方處理對HaCat細胞GSK-3β表達水平有所抑制，這可能與蒿秦化斑方促進PI3K、AKT的磷酸化相關，可見蒿秦化斑方對UVB輻射損傷HaCat細胞PI3K/AKT/GSK-3β通路具有一定調節作用，這與我們在前期研究中得到其能夠抗凋亡、抗氧化、降低炎癥水平的結果一致，可以推測蒿秦化斑方的藥理作用途徑很有可能與PI3K/AKT/GSK-3β通路的激活有關。

總之，蒿秦化斑方能夠以降低由UVB輻射急性損傷造成的HaCat細胞ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1等黏附分子的表達進而緩解局部炎癥和遲發型超敏反應的發生，并且能夠激活HaCat細胞PI3K/AKT/GSK-3β通路，在UVB造成的細胞損傷中起到抗氧化、抗凋亡和降低炎癥反應的作用。

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（2020-11-27收稿 責任編輯：張雄杰）