17β-雌二醇對髁突軟骨細胞增殖的影響機制

張帥 王江紅 田利杰 王寶利 張娟

1.天津醫科大學口腔醫院修復科，天津300070；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院·內分泌研究所，天津300134

顳下頜關節骨關節病（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA） 作為一種退行性關節疾病，其特征是軟骨成分的退變以及軟骨下骨的異常改建[1]。TMJOA 的發病人群主要集中于女性，影像學表現為髁突表面磨損變平或變尖、骨贅形成、囊樣變等，髁突表面軟骨細胞死亡，軟骨基質降解是造成TMJOA的重要原因之一[2-3]。

由于女性易患TMJOA，雌激素在TMJOA 發生發展過程中的作用引起關注。在自然TMJOA 模型中，17β-雌二醇（17β-estradiol，E2） 的應用能有效緩解關節軟骨退變，表明E2 對關節軟骨存在保護作用，然而該保護作用機制尚未明確[4-5]。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 廣泛存在于各種細胞中，在細胞自噬活動中發揮重要調節作用。mTOR 通過磷酸化能夠活化并能有效抑制自噬關鍵標志物脂質化輕鏈蛋白3B （lipid modified of light chain 3B，LC3-Ⅱ） 的形成，從而抑制細胞自噬。近期研究[6]表明，mTOR 信號在細胞生長增殖過程中也起到重要作用。

雷帕霉素（rapamycin，RAPA） 是一種自噬誘導劑，也是特異性mTOR抑制劑，可以抑制mTOR的磷酸化。研究[7]表明，顳下頜關節損傷模型中的軟骨退變會伴有軟骨內自噬水平的降低，而RAPA的應用可以特異性提高軟骨內自噬水平，提高軟骨細胞抗損傷能力并延緩關節軟骨的退變進程。

本實驗通過檢測E2 在不同條件下對髁突軟骨細胞增殖及自噬相關指標的影響，來探討E2 影響髁突軟骨細胞增殖能力的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 周齡雌性SD 大鼠20 只（北京斯貝福公司），動物使用符合我國關于動物保護管理委員會相關規定。

1.2 主要試劑

總RNA 快速提取試劑盒（Omega 公司，美國），高效率逆轉錄試劑盒（Thermo公司，美國），SP-9000 試劑盒（上海生工生物工程有限公司），無酚紅培養基（天津可典生物科技有限公司），雌激素受體α （estrogen receptor alpha，ERα） 單克隆抗體（Abcam 公司，英國），β-actin 單克隆抗體、雌激素受體β （estrogen receptor beta，ERβ） 單克隆抗體、LC3-Ⅱ單克隆抗體（Proteintech公司，美國），E2、RAPA、ERβ 拮抗劑PHTPP、ERα 拮抗劑AZD9496 （MCE 公司，美國），磷酸化雷帕霉素哺乳動物靶標（phosphorylate-mammalian target of rapamycin，p-mTOR） 單克隆抗體（CST 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠髁突軟骨細胞的分離和培養 取大鼠髁突軟骨，剪碎后于15 mL離心管中以0.25% 胰酶消化30 min，終止消化后離心棄去上清液，以0.2%Ⅱ型膠原酶消化5 h 后，接種到含20% 胎牛血清和1% 雙抗的無酚紅高糖DMEM 培養基中，于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每3 d 進行換液。后續實驗以含10% 胎牛血清和1% 雙抗的無酚紅高糖DMEM 培養基進行細胞培養。細胞傳代使用胰蛋白酶消化貼壁細胞，DMEM 終止消化并接種于培養皿中，次日換液。

1.3.2 軟骨細胞的觀察和鑒定 運用倒置顯微鏡觀察并分析各代髁突軟骨細胞形態、胞間連接及胞膜表面是否出現細胞突起。取第3代細胞進行Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，取6孔板圓形空白細胞爬片置于100 mm 培養皿中，設置3 個重復板，滴加細胞懸液并沒過爬片，放入細胞培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，以4% 多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗后于0.5% TritonX-100中室溫孵育20 min，按照SP-9000試劑盒說明進行染色，并孵育Ⅱ型膠原一抗稀釋液，于4 ℃環境下過夜，次日依次加入生物素標記山羊抗兔IgG及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育，使用DAB/AEC 顯色液，室溫孵育5～8 min 后行復染，梯度乙醇脫水封片，顯微鏡下觀察，判讀，觀察細胞胞漿染色變化，深染為陽性改變，如無深染則為陰性改變，對照組細胞使用成纖維細胞。

1.3.3 髁突軟骨細胞的實驗分組 第一部分實驗：E2 對髁突軟骨細胞增殖及自噬的影響。將第二代髁突軟骨細胞分為4組：空白對照組（培養基中僅含等濃度DMSO）、10-6mol·L-1E2 組（實驗組1）、10-8mol·L-1E2 組（實驗組2）、10-10mol·L-1E2 組（實驗組3）。

第二部分實驗：E2 及RAPA 共同作用對髁突軟骨細胞增殖及自噬的影響。將第二代髁突軟骨細胞分為8組：空白對照組（培養基中僅含等濃度DMSO）、10-6mol·L-1E2組（實驗組1）、10-8mol·L-1E2 組（實驗組2）、10-10mol·L-1E2 組（實驗組3）、10-9mol·L-1RAPA 組（實驗組4）、10-6mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 組（實驗組5）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA組（實驗組6）、10-10mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA組（實驗組7）。

第三部分實驗：E2、RAPA 及ERα 拮抗劑AZD9496 或ERβ 拮抗劑PHTPP 共同作用對髁突軟骨細胞p-mTOR表達的影響。將第二代髁突軟骨細胞分為6組：空白對照組（培養基中僅含等濃度DMSO）、10-9mol·L-1RAPA組（實驗組1）、10-8mol·L-1E2 組（實驗組2）、10-8mol·L-1E2+10-9mol·L-1RAPA 組（實驗組3）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1AZD9496 組（實驗組4）、10-8mol·L-1E2+10-6mol·L-1PHTPP組（實驗組5）。

1.3.4 CCK8 實驗 第一部分實驗和第二部分實驗進行CCK8 實驗。取第二代髁突軟骨細胞以每孔2×103個的密度進行鋪板（96 孔板），次日換液給藥，分組按照上述第一部分和第二部分實驗分組執行，每組設置6 個復孔，實驗重復3 次；培養時間分為24、48、72 h。于各培養時間點換液后每孔加入10 μL CCK8 溶液，置于37 ℃，5%CO2培養箱中孵育2 h；處理結束后于全波長掃描酶標儀（BioTek公司，美國） 在波長450 nm下測定各孔光密度（optical density，OD） 值。

1.3.5 逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 檢測髁突軟骨細胞自噬及增殖相關基因表達 第一部分實驗進行RT-PCR 實驗。取第二代髁突軟骨細胞以每孔2×104個的密度進行鋪板（24 孔板），次日換液給藥，分組按照上述第一部分實驗分組執行，每組設置3個復孔，實驗重復3次；培養第48小時收集細胞。總RNA 快速提取試劑盒提取細胞總RNA；高效率逆轉錄試劑盒進行細胞總RNA 逆轉錄；2×SYBN Green qPCR Kit （上海生工生物工程有限公司） 檢測ERα、ERβ、Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，COLⅡ）、自噬相關基因6 （autophagy-related gene 6，ATG-6/Beclin-1）、自噬相關基因5 （autophagyrelated gene 5，ATG-5） 基因表達水平；以β-actin作為內部參照基因，采用2-ΔΔCT法進行統計。本實驗所采用的RT-PCR引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.3.6 蛋白印跡（Western blot） 檢測髁突軟骨細胞自噬及增殖相關蛋白表達 各部分實驗均進行Western blot 實驗。取第二代髁突軟骨細胞以每孔2×105個的密度進行鋪板（6 孔板），次日換液給藥，分別按照以上對應實驗部分進行分組，每組設置3 個復孔，實驗重復3 次；第一部分實驗于培養24、48、72 h 后收集細胞；第二、三部分實驗于培養48 h后收集細胞。RIPA裂解細胞提取蛋白；BCA 法測定蛋白濃度；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE） 法分離蛋白；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF） 膜轉膜；5% 牛奶室溫封閉1 h 后加入一抗液（ERα、ERβ、Beclin-1、LC3-Ⅱ、p-mTOR，1∶1 000 稀釋） 于4 ℃環境下孵育過夜；次日，TBST 蕩洗5次，隨后加入二抗液（HRP 標記的山羊抗兔IgG，3∶1 000 稀釋、HRP 標記的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000 稀釋） 室溫孵育2 h；TBST 蕩洗3 次后采用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL） 液顯影，Image-J分析條帶灰度值，計算相對表達量。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，對所測結果進行正態性及方差齊性檢驗，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。當P＜0.05 時認為實驗數據差異有統計學意義。

2 結果

2.1 髁突軟骨細胞的培養和鑒定

接種后，原代細胞表現為較小的三角形形態，散在分布；第一代到第三代軟骨細胞表現為典型“鋪石路” 樣，且生長較快，胞核明顯，狀態較好；第五代到第七代軟骨細胞可見成纖維樣細胞成分開始有所增加，但主體仍為軟骨細胞，生長狀態較好；第九代軟骨細胞中，細胞形態全部轉化為成纖維型，并有多個突起，增殖能力顯著下降（圖1A）。第三代軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色后，可見軟骨細胞胞漿呈棕褐色改變，顯示為陽性變化；非軟骨細胞胞漿無深染，呈陰性變化（圖1B）。

圖1 髁突軟骨細胞形態及其Ⅱ型膠原免疫組織化學染色Fig 1 The morphology and immunohistochemical staining of type Ⅱcollagen of condylar chondrocytes

2.2 髁突軟骨細胞在不同濃度E2 作用下的增殖變化

不同E2 濃度下，檢測軟骨細胞在給藥后24、48、72 h 的增殖水平（圖2）。由圖2 可見，給予E2 后，髁突軟骨細胞的增殖速度顯著加快，并存在明顯的中間最優濃度及雙向性作用，表現為在E2 濃度為10-8mol·L-1時，髁突軟骨細胞增殖最快（P＜0.05），而低于或高于該濃度會不同程度地降低E2 對髁突軟骨細胞增殖的促進作用。同時各組細胞數量均在第48 小時達到頂峰，在第72 小時達到平臺期并發生下降。

圖2 E2對髁突軟骨細胞增殖的影響Fig 2 The effect of E2 on the proliferation of condylar chondrocytes

2.3 E2 對髁突軟骨細胞增殖、自噬相關靶標表達的影響

RT-PCR 結果顯示在培養第48小時，各組細胞中ERα 和ColⅡ的基因表達水平隨E2 濃度的增加而先升高后降低，呈現 “倒V 形”，并在濃度為10-8mol·L-1時達到峰值（P＜0.01），ERβ 的基因水平則無明顯變化。同時，Beclin-1 和ATG-5 的基因水平在低濃度E2處理組（10-10、10-8mol·L-1） 中顯著低于對照組（P＜0.05）（圖3A～E）。

Western blot實驗結果與RT-PCR實驗結果趨于相同，如圖3F 所示，在培養第48 小時，與空白對照組相比，E2 處理組中p-mTOR 表達顯著升高，Beclin-1 和LC3-Ⅱ表達降低，其中p-mTOR 蛋白在10-8mol·L-1E2 組中表達量最高（P＜0.05）；同時，在10-8mol·L-1E2 組中，ERα 表達量達到最高（P＜0.05），ERβ的表達則沒有明顯變化（P＞0.05）。

10-8mol·L-1E2 組在第24、48、72 小時各蛋白表達量的表達結果見圖3G。在第48 小時，細胞中p-mTOR 和ERα 的表達量最高，高于第24、72 小時相應蛋白表達量（P＜0.05）；在第72小時，相較于第24、48小時，細胞中Beclin-1、LC3-Ⅱ、ERβ的表達量明顯升高，p-mTOR和ERα的水平顯著下降（P＜0.05）。

圖3 E2對髁突軟骨細胞增殖、自噬相關靶標表達的影響Fig 3 The effects of E2 on the expression of targets related to proliferation and autophagy of condylar chondrocytes

2.4 p-mTOR 在E2 促進髁突軟骨細胞增殖中的作用

為驗證E2 對髁突軟骨細胞增殖的促進作用是否涉及p-mTOR，實驗中應用mTOR 特異性抑制劑RAPA，結果見圖4A～C，CCK8實驗結果表明，用RAPA 處理髁突軟骨細胞后，在各培養時間點，細胞增殖水平均顯著低于單純E2組（P＜0.05）。Western blot 實驗結果顯示，RAPA 能夠抑制對照組和實驗組細胞中p-mTOR 的表達，促進Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達（P＜0.01），但對ERα 和ERβ 表達的影響不具有統計學意義（P＞0.05）（圖4D）。

圖4 RAPA對E2促進髁突軟骨細胞增殖的影響Fig 4 The effect of RAPA on the proliferation ability of condylar chondrocytes with different E2 levels

2.5 雌激素受體抑制劑對E2 作用下髁突軟骨細胞中p-mTOR蛋白表達的影響

在10-8mol·L-1E2 處理組中， 加入AZD9496后，軟骨細胞中p-mTOR的表達明顯降低，接近對照組水平（P＜0.01），而加入PHTPP 后，與單純10-8mol·L-1E2處理組相比，p-mTOR的表達差異無統計學意義（P＞0.05）（圖5）。

圖5 雌激素受體抑制劑對各組軟骨細胞中p-mTOR蛋白表達的影響Fig 5 The effect of estrogen receptor inhibitors on the p-mTOR expression of chondrocytes

3 討論

TMJOA 是一種發生于軟骨和軟骨下骨的漸進性退行性疾病，軟骨的退變核心在于軟骨細胞的死亡以及軟骨基質的降解破壞。既往研究表明，E2的應用能有效緩解關節軟骨退變[4-5]，對體外培養的髁突軟骨細胞起到雙向調節作用（低濃度促進細胞增殖，高濃度抑制細胞增殖），并在10-8mol·L-1濃度下對體外培養的人胚或兔髁突軟骨細胞具有最顯著的促增殖作用[8]。在本實驗中，10-10、10-8mol·L-1E2 處理后的大鼠髁突軟骨細胞增殖活力明顯高于對照組，也驗證了E2 對髁突軟骨細胞具有促增殖作用。然而E2 對髁突軟骨細胞的作用機制尚未明確。

自噬是一種細胞內部調節過程，起到雙向作用。一方面，自噬是一種細胞在應激狀態下的適應性反應，促進細胞存活；另一方面，過度自噬會引發Ⅱ型程序性細胞死亡，參與疾病的發生發展。mTOR 信號分子是細胞中廣泛存在的調節因子，在細胞自噬及增殖活動中發揮重要作用[7]。髁突軟骨作為下頜骨生長發育及負重中心[9]，其細胞中mTOR 的作用機制可能更加復雜。既往研究[10]表明，mTOR 的磷酸化狀態受到抑制后，細胞會激活本體自噬反應，并可觀察到細胞生長速度減緩。因此本研究旨在探討自噬反應是否參與了E2對髁突軟骨細胞增殖活動的調節。

以往相關研究發現，E2作用于不同細胞系后，細胞中的自噬反應變化不同[11-12]，有結果顯示E2可以促進人永生化軟骨細胞系p-mTOR表達，抑制其自噬活動[11]；而同樣有結果顯示E2 作用于人子宮內膜癌細胞后會抑制細胞中p-mTOR表達，促進其自噬活動[12]。本研究中Western blot 結果顯示，在E2 處理的髁突軟骨細胞中，p-mTOR 表達量升高，Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達量降低，細胞自噬受到抑制，并且這種變化呈現出劑量依賴性的特點，表現為當E2 濃度為10-8mol·L-1時，p-mTOR 升高最明顯，而高于或低于該濃度，p-mTOR的水平都會相對降低，提示E2 對細胞增殖活動的調節中可能涉及p-mTOR分子。

RAPA 是一種特異性mTOR 抑制劑及自噬誘導劑，可特異性抑制mTOR 的磷酸化修飾[13]。本實驗中，RAPA 的應用顯著降低了細胞中p-mTOR 水平，并降低了細胞增殖活性，這可能是由細胞自噬活動增強，自身相對穩態增加，同時抑制自身有絲分裂活動所導致的[13]。該結果進一步驗證mTOR 的磷酸化形式在細胞增殖過程中具有重要作用。而RAPA對關節損傷模型中軟骨的保護作用可能是通過促進軟骨細胞自噬活動，將更多蛋白質用以修復細胞損傷而實現的，從而能夠延緩關節軟骨退變進程。

大量早期實驗均提及到E2 主要通過兩大核受體ERα、ERβ發揮其生物學效能，如調節細胞凋亡等[14]。在本研究中，ERα在軟骨細胞中的表達隨著E2 處理濃度的升高而變化，并在10-8mol·L-1的濃度下達到峰值，并與細胞中p-mTOR水平呈現出明顯正相關性，此外，p-mTOR和ERα的表達量變化也呈現出與培養時間相關的一致性，表現為在第48 小時，p-mTOR 和ERα 蛋白表達量最高，并與該濃度下，細胞的增殖變化趨勢一致。表明E2 可能通過ERα 激活mTOR 并發揮作用。為驗證E2 是否通過雌激素受體進而調節mTOR 的磷酸化修飾，實驗中應用了ERα 拮抗劑AZD9496 和ERβ 拮抗劑PHTPP，結果顯示，當應用AZD9496 后，細胞中mTOR 的磷酸化水平明顯降低，并接近對照組水平；而應用PHTPP 后，細胞中p-mTOR 水平未有明顯變化。說明E2 至少可以通過ERα 而非ERβ 改變細胞中p-mTOR水平并進而影響細胞增殖活力。

以上研究表明，E2 可以通過ERα-p-mTOR 通路抑制細胞自噬，促進細胞增殖，提示E2-ERα-pmTOR 通路在TMJOA 的發生發展中可能發揮作用。值得注意的是，本實驗在第一階段（雌激素處理階段），發現在E2 處理后第48 小時，高濃度E2 （10-6mol·L-1） 條件下，細胞中自噬相關標志物在基因水平上高于對照組，但在蛋白水平上低于對照組，提示高濃度E2 對髁突軟骨細胞中自噬的調節可能存在時效性及雙向性作用，即初期抑制細胞自噬，后期促進細胞自噬。并且，Xiang 等[15]研究表明E2 對乳腺癌細胞自噬的調節確實存在雙向性作用，能夠將細胞中自噬水平維持在一個穩定的范圍內，而自噬水平的失衡可能會導致細胞增殖活性的改變；此外，何磊等[12]實驗中用于處理細胞的E2 濃度遠超10-6mol·L-1，而結果顯示該條件下，細胞的自噬作用增強，這些結果均說明不同濃度E2 對同種細胞或不同細胞的效應具有差別，甚至作用相反。因此，關于高濃度E2 對于髁突軟骨細胞中p-mTOR及自噬的調節機制和意義尚需進一步研究。

綜上所述，本實驗闡明在10-8mol·L-1E2 條件下，E2 能通過ERα 途徑促進p-mTOR 的表達，并在體外培養的髁突軟骨細胞增殖活動中發揮正向調節作用，該研究或可為探究E2 與TMJOA 之間的關系提供一個新的思考方向，然而鑒于本實驗所采用的E2 濃度的局限性以及體外細胞實驗具有的偏差性，E2 與p-mTOR 和細胞或組織之間的具體作用機制還需進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。