框架核酸在骨再生領域應用的研究進展

林云鋒

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心

四川大學華西口腔醫院口腔頜面外科，成都610041

創傷和骨疾病，如骨質疏松癥和骨代謝異常，可造成骨折和缺損，常常需要骨修復和再生治療[1]。隨著骨疾病發病率上升和老齡化人口增加，這種需求日益加劇。而目前臨床上有針對性地修復和重建骨缺損，仍然是一個挑戰。自1997 年Cao 等[2]首次提出 “組織工程” 這一定義以來，其已被設計用于損傷、病變組織再生。其中骨組織工程作為針對骨修復再生的組織工程為骨缺損患者帶來了福音，其基本過程是利用細胞、支架、生物活性因子的組合，在體外預培養細胞增殖分化、基質形成和骨重塑，然后將載細胞材料植入人體，引導骨再生[3-4]。然而，目前的生物材料的成骨效果有限，并傾向于降低細胞的活性，因此亟需新型的成骨材料。

自1982 年Seeman[5]提出用DNA 構建固定連接的創新思想來，DNA 納米技術在過去幾十年里以驚人的速度發展。從霍利迪連接到DNA 瓷磚[6]、二維晶格[6-7]，再到高階DNA 折紙[8]和DNA 納米復合物[7]，多種DNA 納米結構應運而生，由于其在生物介質中具有較高的抗酶降解能力、可編輯性、可控性和良好的力學性能，而逐漸受到人們的關注。在不同形式的DNA 納米結構中，以框架形態為特征的框架核酸（framework nucleic acid，FNA）納米結構，被認為是最有前途的類型之一[9-10]。有越來越多的證據表明，FNA 可通過多個機制促進骨再生修復，具體來說：1） FNA 可誘導多種干細胞成骨分化，如FNA幫助分離和富集骨骼干細胞，誘導脂肪源性干細胞、口腔源性干細胞的增殖、遷移和成骨分化；2） FNA 可促進血管生成，進而促進骨再生；3） FNA 可促進神經化骨組織再生；4） FNA可參與骨組織免疫調節?？傊?，FNA在構建骨組織再生微環境中具有巨大的應用潛力，現將FNA在骨組織再生工程中的研究現狀作一綜述。

1 FNA 作為納米材料在骨再生組織工程中的應用優勢

從材料的角度看，骨是一種由有機（主要是納米膠原纖維） 和無機（納米晶羥磷灰石） 組成的納米材料，具有從納米到宏觀的層次結構。納米技術的總體理念是通過操縱材料的最小成分來控制其結構和產生的特性來設計材料，由于天然骨組織的納米級結構特征對其獨特性至關重要，因此納米材料很容易在骨再生中得到應用。

納米材料在骨再生組織工程中的應用優勢，具體表現在5 個方面：1） 生物材料中適當的成分可以為骨的生物礦化提供持續的營養；2） 材料的納米特性可能介導細胞行為（細胞黏附、細胞分化） 和骨整合；3） 納米元素本身是很好的增強劑，可以提高新生骨的強度[11-13]；4） 納米材料呈現出的宏觀或微觀納米多孔結構的層次結構，有利于細胞滲透、營養或廢物運輸、骨內生長和血管化；5） 納米結構的引入可能改變生長因子的傳遞方式，使支架具有吸收內源性細胞和加速新骨和血管形成的能力[14]。

盡管可供骨組織工程應用的納米材料有很多，但大多數尺寸和形狀很難實現精確控制。相反，由DNA 納米技術構建出的三維FNA 納米結構，具有分子量單一、結構明確、尺寸形狀可控等力學性能可調的特點，為納米材料在骨組織工程中的應用提供了先進的工具。在進一步的發展中，具有預定尺寸和功能的多種FNA 結構被設計合成，包括四面體、立方體、八面體、十二面體空心球體等[15-18]。其中，最簡單最穩定的框架結構模型之一是4 條特定單鏈DNA 通過互補堿基配對自組裝的四面體框架核酸（tetrahedral framework nucleic acid，tFNA）。tFNA在骨再生領域應用具有眾多優勢：1） 組裝快速，組裝合成需0.5 h 左右；2） 產率高，可達90%；3） 結構穩定，具有相對血清穩定性和一定的機械剛度；4） 強大的入胞能力，tFNA 可以通過多種活細胞的細胞膜甚至微生物的硬壁，它以頂角迅速攻擊細胞膜，使電荷排斥最小化并引發電荷再分配，隨后通過小窩蛋白介導的內吞途徑進入細胞質，然后以微管依賴性的方式轉移到溶酶體中，也正因為這一特性，tFNA 還可以作為載體間接幫助骨再生[19-24]。

2 FNA誘導干細胞成骨分化與骨再生

多能干細胞由于自我更新和多系分化性質，而被認為是組織工程中的一種很有前途的解決方案。胚胎干細胞和成體干細胞是哺乳動物常見的干細胞，由于人類胚胎干細胞的來源和倫理要求有限，成體干細胞在組織工程中的應用更為普遍。成體干細胞中的骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSC） 和脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSC） 因其操作簡便、操作簡單、不存在美學難題等優點，在骨修復的細胞治療中顯示出巨大的應用前景。

2.1 FNA幫助分離和富集骨骼干細胞

人骨髓中含有大量的骨骼干細胞（skeletal stem cells，SSC），具有向成骨、成脂肪和成軟骨細胞分化的能力。起初，BMSC 只能在體外培養基上分離，干細胞種類豐富，但這些并不是最原始的SSC。在缺乏特異性SSC 標記物的情況下，目前從人體組織中分離和富集SSC 的方法仍具有挑戰性。

Xavier等[25]將多個寡核苷酸通過硫醇鍵連接固定在金納米離子上形成球形核酸（spherical nucleic acids，SNA），該結構不僅可以檢測基于mRNA表達的SSC，而且可以快速從人骨髓中分離SSC，而不影響骨骼細胞的長期存活，這是組織工程策略中利用SSC 幫助骨再生的關鍵。盡管骨髓中存在SSC數量有限，但該研究表明在骨髓的每200個SSC中，SNA能特異性的檢測和富集1個，這相當于一個50～500 倍的富集。再加上這種策略的速度和簡單性，這種方法具有廣泛的應用潛力。

2.2 FNA 誘導脂肪源性干細胞的增殖、遷移和成骨分化

脂肪組織來源的干細胞已被認為是一種可行的替代方案，因為它們具有體外成骨能力，易獲得性以及在低氧和低糖環境中生存的能力[26-27]。

目前，ADSC在許多動物模型中被廣泛應用于骨缺損的修復和重建。然而，僅依靠ADSC 的成骨分化能力不足以修復大骨缺損。Shao 等[28]將ADSC 暴露于250×10-9mol·L-1濃度的tFNA 后，堿性磷酸酶染色和鈣沉積實驗表明，tFNA 通過促進堿性磷酸酶活性和促進基質礦化，在促進骨形成中起重要作用。經典Wnt/β-連環蛋白通路的激活似乎是tFNA 誘導ADSC 成骨分化的主要機制，Wnt/β-連環蛋白通路是調節細胞成骨分化的重要信號，與骨形成和發育密切相關[29-30]。Wnt 與受體結合后產生下游信號，激活β-連環蛋白，減少β-連環蛋白的降解，Wnt/β-連環蛋白信號的激活導致Runt相關基因2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2） 的表達，Runx-2被認為是主要的成骨轉錄因子和成骨細胞[31-32]的最早標記。隨后，Runx-2的表達誘導成骨相關蛋白的表達，并調節成骨分化。此外，Wnt 信號還可以抑制脂肪形成的早期階段，同時促進成骨[33]。250×10-9mol·L-1濃度的tFNA 可能提供一種獨特的細胞環境，促進ADSC 的成骨分化和增殖，為其在骨組織再生治療中的潛在應用開辟了未來的機會。

細胞遷移是非常復雜的細胞行為，是許多生物學過程（包括胚胎發育、組織再生和免疫反應）的關鍵組成部分[34-37]。在機制方面，已經廣泛證明蛋白質Ras相關C3肉毒菌毒素底物（ras-related C3 botulinum toxin substrate，RAC） 和視紫質重組蛋白（recombinant rhodopsin，RHO） 的相互調節對細胞遷移至關重要。Shi等[38]將ADSC 暴露于tFNA后，結果表明，tFNA 以濃度依賴性的方式促進ADSC 的細胞遷移。值得注意的是，當tFNA 被ADSC 內化時，它們抑制lncRNA XLOC 101623 的轉錄，激活TIAM1/RAC1和RHOA/ROCK2信號通路，導致相關基因和蛋白質表達的改變，最終促進ADSC 的遷移?；谶@些發現，tFNA 作為一種功能性三維DNA 納米材料，在組織修復和再生醫學中顯示出了很高的應用潛力。Lin 等[39]進一步的特異性聚合酶鏈反應和基因功能分析顯示，tFNA通過Dlg3 基因啟動子的DNA 甲基化，促進ADSC增殖。此外，tFNA 還降低了ADSC 中凋亡相關蛋白半胱天冬酶-3 （casepase3） 和Bcl-2 相關X 蛋白（bax） 的基因和蛋白質表達，這些結果表明，tFNA有助于抑制ADSC的凋亡。

2.3 FNA 誘導口腔源性干細胞的增殖、遷移和成骨分化

最近，越來越多的研究[26,40-43]開始關注口腔間充質干細胞以及生物制骨。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC） 和牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC） 作為分別來源于牙周膜和牙髓的間充質干細胞，具有強的可克隆、自我更新和多能性等多種優勢，可以在不同的誘導條件下分化為神經、骨、肌肉和脂肪組織等各種組織。此外，與BMSC 相比，PDLSC 和DPSC由于創傷小，免疫原性低，被認為是口腔骨再生中理想的種子細胞，特別是對牙槽骨缺損的重建。

根據先前的一些研究表明，PDLSC 可以分化為成纖維細胞、成骨細胞樣細胞和骨水泥細胞樣細胞，以產生天然的牙周組織、骨樣組織和骨水泥組織。DPSC 可以在不同的細胞微環境中誘導形成骨、脂肪、牙齒、神經、肌肉、血管組織[44-48]。此外，PDLSC 和DPSC 已經被加載到各種各樣的支架材料上，如羥磷灰石、膠原海綿、殼聚糖和水凝膠，然后移植到動物模型中，以探索其對骨和牙組織再生的能力[49-51]。Zhou 等[52]利用tFNA 刺激PDLSC 來調節其生物行為，研究結果表明，250×10-9mol·L-1濃度的tFNA 能通過調節Wnt/β-連環蛋白通路， 促進PDLSC 的增殖， 大大增強PDLSC 的成骨分化。進一步研究[53]表明，tFNA 還可以促進PDLSC 在體外的遷移；促進成骨相關因子Runx2、骨橋蛋白的表達，從而促進成骨分化；明顯抑制牙周炎對牙周組織的破壞。這些作用可能與tFNA 抑制腫瘤壞死因子α、白細胞介素-1、白細胞介素-6、一氧化氮以及細胞活性氧的產生，抑制破骨細胞的生成從而減少牙槽骨的吸收有關。另一項研究[54]結果表明，tFNA 不需要其他轉染試劑的輔助就可以被導入DPSC。同時，tFNA 通過上調經典Notch 信號通路相關基因和蛋白的表達，促進了DPSC 的增殖和成骨/成牙分化。因此，利用tFNA 作為新型的框架核酸納米材料，可以被認為是DPSC為基礎的骨和牙組織再生的一個有希望的替代方法。

3 FNA血管調節作用與骨再生

骨組織作為一種高度血管化的組織，其形成過程往往離不開血管的生長與生成。血管可以為細胞提供足夠的營養和氧氣，以維持細胞和新形成的組織的活力。骨血管化不足可能導致細胞和/或組織死亡，阻礙骨形成和/或減少新形成的骨量[55]。新生血管為骨移植工程的仿生研究增加了第四維度，已經被證明是移植存活，整合和宿主功能的關鍵[56]。

血管與骨組織之間的耦合作用涉及多種復雜的機制，其中內皮細胞的Notch通路激活可有效促進骨骼中的血管生成和成骨[57]。有研究[58]表明，在250×10-9mol·L-1濃度下，tFNA 可進入內皮細胞，并通過激活Notch 信號通路，促進內皮細胞的增殖、遷移；通過上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 及其受體、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP） 等多種血管生成生長因子的表達，促進血管生成，這為FNA 進一步在血管和成骨組織工程中的應用提供了理論基礎。另外，tFNA 的血管生成作用在Lin 等[59]的研究中也得以驗證，該研究表明，在血管的炎癥和氧化損傷反應中，tFNA 可通過活化Akt促進VEGF基因的表達和新血管的形成。

雙膦酸鹽相關的頜骨壞死（bisphosphonatesrelated osteonecrosis of the jaw，BRONJ） 是一種嚴重影響患者的生活質量的骨代謝疾病，其發生可能是由骨代謝不平衡、抗血管生成、異常的免疫功能等一種或多種原因引起的[60]。雙膦酸鹽可通過抑制多種血管生成因子的表達，進而抑制血管的生成，從而導致頜骨缺血壞死。其中VEGF是刺激血管生成的特異性因子，可以促進內皮細胞的存活、增殖、遷移，并增加血液通透性[61]。缺氧誘導因子1α 可以促進血管形成和參與介導血管與骨組織之間的耦合作用[62]，MMP2 和MMP9 可以降解細胞外基質，促進內皮細胞遷移，并為血管的生成打開空間[63]。在Zhao 等[64]的體外研究中，tFNA 可通過上調上述血管生成生長因子的表達，發揮其促進血管生成的能力并逆轉雙膦酸鹽對血管生成的抑制作用。這一結果在其體內實驗中也得以驗證，tFNA 可以促進BRONJ 大鼠血管的生成，并減少拔牙部位的骨骼暴露，進而增加拔牙部位牙槽骨的相對高度，最終很大程度上改善了BRONJ的預后。值得注意的是，在tFNA促進血管生成的機制上，該研究認為信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT） 起到了關鍵的作用，tFNA 可以在雙膦酸鹽刺激的環境中促進STAT 的磷酸化，從而促進血管生成。

4 FNA的神經調節作用與骨再生

除了血管化，神經化骨組織的產生也被認為是骨組織工程最大的障礙之一，感覺神經和自主神經的神經支配與骨穩態調節之間的關系越來越受到重視。根據希爾頓規則[65]，支配肌肉的神經也支配附著的骨骼，此外，伴隨血管的大神經束在不同部位滋養骨骼。大量對機械應力和疼痛敏感的感覺神經纖維支配小梁骨和骨膜[66-67]，這些感覺神經纖維可通過分泌感覺神經遞質[68-69]影響骨代謝和骨重塑；此外，重建神經支配能夠有效預防骨移植的骨質疏松，這提示神經支配可能在促進組織工程骨形成中發揮了重要的作用[70]。

在神經組織重建過程中，神經干細胞向損傷區遷移，并在損傷區分泌一定的生長因子，會進一步加速神經干細胞的遷移，進而分化為神經細胞[71]，這是神經及其附屬細胞修復和再生的關鍵過程。然而，神經干細胞的增殖、遷移和分化能力較差，很難修復和再生損傷的神經組織。因此，研究安全有效地促進神經干細胞遷移的生物材料，對神經化骨組織的產生具有重要意義。Ma 等[24]的一項研究結果提示，250×10-9mol·L-1濃度的tFNA通過激活Wnt/β-連環蛋白通路，進而促進了小鼠神經干細胞的增殖，并通過抑制Notch信號通路促進了神經元的分化，并進一步用劃痕實驗和transwell 小室實驗研究不同條件下培養小鼠神經干細胞的遷移行為，結果發現，干細胞能快速內化tFNA，并有效促進細胞的平行和垂直遷移。此外，tFNA 能夠上調RhoA、Rock2 和黏著斑蛋白的基因和蛋白表達水平，這表明tFNA 在細胞遷移過程中激活了RhoA/Rock2 通路，最終促進小鼠神經干細胞的遷移[72]。這些結果表明，tFNA 在神經組織修復和再生方面有很大的應用潛力。

5 FNA的免疫調節作用與骨再生

在某些情況下，當骨缺損較大或并存某些疾?。ㄈ缒[瘤、骨質疏松癥） 時，可能需要使用合成骨移植物來促進骨再生過程。在這些情況下，外源性的生物材料會立即觸發宿主反應，包括蛋白質吸附、血凝塊形成和炎癥過程。免疫系統在骨中的作用，并不局限于細菌產物和抗原[73-74]的吞噬功能或對骨損傷的反應[75-77]，免疫系統在骨中的相關功能還包括：刺激成骨細胞的礦化、多核巨細胞和破骨細胞的形成、參與建模和重塑階段以及維持骨組織的內穩態[78]。因此，開發能夠通過與免疫系統的正反饋促進組織愈合的生物材料，目前正成為一個基礎研究課題。

巨噬細胞是免疫系統的主要組成部分之一，其分化為促炎或抗炎表型對細胞干擾和隨后的正常骨再生過程有很大影響。巨噬細胞的這種調節作用是至關重要的，因為它可以誘導和決定骨組織主動再生或持續炎癥的兩種不同結局。經典活化巨噬細胞M1表型作為促炎性巨噬細胞，分泌各種促炎因子，如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1、白細胞介素-6、活性氧、一氧化氮等，維持骨組織炎性損傷反應；替代活化巨噬細胞M2表型作為抗炎癥的巨噬細胞分泌抗炎因子，如抗炎因子白細胞介素-10 和轉化生長因子-β，有助于消除炎癥，促進傷口愈合和組織重塑[79-82]。

Zhao 等[64]的研究表明，tFNA 可以在無載體的情況下進入小鼠單核巨噬細胞，減少脂多糖聯合干擾素-α 處理后M1 型標志物誘導型一氧化氮合酶，促炎因子（腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1、白細胞介素-6），一氧化氮和活性氧的產生，同時M2 型標志物精氨酸酶1 和白細胞介素-10、轉化生長因子-β 表達增加，提示tFNA 抑制了巨噬細胞M1表型極化，并促進了巨噬細胞向M2表型極化，在阻止炎癥反應進程的同時，促進了傷口愈合和骨組織重塑。進一步研究表明，tFNA 在體內外通過調節STAT 的磷酸化，促進巨噬細胞向M2 型極化，這為tFNA 作為骨免疫調節材料，在骨愈合的各個階段支持骨組織的再生提供了理論依據。另外，在牙周病的細菌感染過程中，牙周組織細胞會暴露于外源性炎癥因子如脂多糖中，Zhou 等[53]將250×10-9mol·L-1濃度tFNA 加入脂多糖刺激后的牙周膜干細胞中觀察到，牙周膜干細胞分泌了促炎細胞因子，并且其細胞活性氧水平降低，成骨分化增加。這一結果在絲線結扎致牙周炎的體內牙周炎模型中也得以證實， 250×10-9mol·L-1和500×10-9mol·L-1濃度tFNA 通過減少炎癥滲出和抑制破骨細胞的形成，均減少了牙槽骨的吸收。進一步研究表明，tFNA 的體內外免疫調節作用與減少白細胞介素-1、白細胞介素-6等抗炎因子的釋放有關，從而抑制了破骨細胞的生成，對牙周組織包括牙槽骨、牙骨質和牙周韌帶有明顯的保護作用。

6 總結與展望

綜上所述，FNA 獨特的物理和化學性質吸引了大量學者對其進行研究。如圖1所示，在骨組織再生方面，FNA 可以調節干細胞的增殖遷移和成骨分化，可以通過骨組織納米外環境模擬、骨組織血管化、神經化以及炎癥免疫調節，為骨組織再生提供良好的內外環境。值得注意的是，FNA強大的入胞能力和可編輯特性，為骨組織再生過程中各種生長因子和小分子藥物的靶向遞送和可控性釋放提供了巨大的可能性。筆者相信，FNA將會是未來促進血管化和神經支配骨組織產生的一種重要手段，在骨修復和再生方面具有巨大的潛力。

圖1 FNA在骨再生領域的應用Fig 1 Application of FNA in bone regeneration

雖然FNA 已被報道在骨再生領域具有巨大潛力，但FNA 在骨組織修復和再生中的應用仍然具有挑戰性。許多研究仍處于初級階段，迫切需要進一步的探索才能實際應用。在未來可能需要通過精細調整其結構，在組成、結構、生物功能以及骨愈合過程中結合仿生特性和生物功能的新策略，完全實現組合模擬，為原位骨再生創造真實的模擬微環境，可以賦予FNA 更有效和更好的骨再生能力。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。