高效液相色譜法測定藜麥中齊墩果酸的含量

田建文,王彩艷,王 芳*,趙子丹

(1.寧夏農林科學院,銀川 750002;2.農業農村部 枸杞產品質量監督檢驗測試中心,銀川 750002)

藜麥是藜科藜屬的一年生草本植物[1],含有豐富的蛋白質、膳食纖維、礦物質、氨基酸[2]、維生素等多種營養物質[3],被聯合國糧食及農業組織認定是唯一滿足人體基本營養需求的單體植物,并正式推薦為最適宜人類的“全營養食物”[4]。而藜麥中含有的皂苷成分是抗營養物質[5],通常以齊墩果酸、三萜類皂苷、商陸酸等形式存在[6-7]。其中,齊墩果酸具有護肝解毒、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫、降糖和利尿等生物活性功能[8-9]。

目前齊墩果酸的測定方法主要有紫外分光光度法[10]、液相色譜-串聯質譜法[11]、薄層色譜掃描法[12]、香草醛高氯酸法等。藜麥的品種多樣,其提取液呈現不同顏色,采用紫外分光光度法測定時,顏色干擾嚴重,導致結果不準確;液相色譜-串聯質譜儀價格高,推廣有一定局限性;薄層色譜掃描法顯色斑點不清晰,難以得到滿意的結果;香草醛高氯酸法測定過程復雜,分析效率較低,使用的高氯酸和乙酸具有強腐蝕性。因此,需要建立一種靈敏度高、準確度高的簡單高效分析方法。本工作通過優化齊墩果酸的提取方法和色譜條件等,建立了高效液相色譜法測定藜麥中齊墩果酸含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD 型高效液相色譜系統,配紫外檢測器和Lab Solutions色譜工作站;PL202-S 型電子天平;KQ5200DE型數控超聲波清洗器;XMTD-4000型電熱恒溫水浴鍋。

齊墩果酸標準儲備溶液:1.000 g·L－1,稱取齊墩果酸標準品10 mg(精確至0.00001 g),用10 mL甲醇溶解,配制成質量濃度為1.000 g·L－1的齊墩果酸標準儲備溶液,于－18 ℃保存。

齊墩果酸標準溶液系列:移取適量的齊墩果酸標準儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成質量濃度為5,10,20,100,200,500 mg·L－1的齊墩果酸標準溶液系列,于－18 ℃保存。

齊墩果酸標準品的純度不小于98%;藜麥樣品采自寧夏固原地區;鹽酸、乙酸銨、乙醇均為分析純;甲醇為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Agilent TC-C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);柱溫35℃;流量1.0 mL·min－1;進樣量10μL;流動相為體積比85∶15 的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液;等度洗脫;檢測波長215 nm。

1.3 試驗方法

對藜麥樣品進行脫殼處理,稱取藜麥1.5 g于150 mL磨口錐形瓶中,加入甲醇40 mL和3 mol·L－1鹽酸溶液10 mL,超聲提取20 min,再回流水解1.5 h,所得提取液按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗選用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%(體積分數)乙酸溶液的混合液、乙腈-含0.5%(體積分數)乙酸銨的甲醇溶液的混合液、甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液5 種不同流動相體系,以Agilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)為色譜柱時,經高效液相色譜分析,均可有效分離目標成分齊墩果酸。結合出峰時間、峰形、雜質的干擾等因素,試驗最終選擇甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液混合液為流動相,并考察了甲醇和0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的體積比分別為85∶15,90∶10,88∶12,80∶20時對齊墩果酸分離效果的影響。經對比分析,以體積比為85∶15的甲醇-0.1 mol·L－1乙酸銨溶液的混合液為流動相時,齊墩果酸分離效果較好。

2.2 提取方式的選擇

齊墩果酸常用的提取方式有溶劑提取、超聲輔助提取、微波輔助提取[13]。根據齊墩果酸可溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮和三氯甲烷等有機溶劑,不溶于水的特性[14],試驗考察了超聲、勻漿、振蕩3種提取方式對齊墩果酸測定值的影響。結果表明,經上述3種方式提取后,雜質干擾嚴重,齊墩果酸不能很好地分離,進而影響其測定結果,無法得到準確的測定值。齊墩果酸通常以游離酸的形式存在,經水解可將其轉化成苷元以排除雜質干擾,故考慮采用酸水解的方式提取齊墩果酸。

以甲醇-3 mol·L－1鹽酸溶液的混合液為提取劑,考察了直接酸水解(直接酸水解1.5 h)和超聲-酸水解(先超聲提取20 min,再回流水解1.5 h)兩種提取方式對齊墩果酸測定值的影響。結果表明,經上述兩種方式提取后,齊墩果酸的測定值依次為2.54,2.99 g·kg－1;樣品經超聲-酸水解后,能有效排除雜質的干擾,同時對該提取方式進行加標回收試驗,驗證方法的可行性,回收率為99.2%。因此,試驗選擇超聲-酸水解的方式來提取藜麥中的齊墩果酸。

2.3 提取劑的選擇

試驗采用超聲-酸水解的提取方式,進一步考察了甲醇-鹽酸溶液的混合液、乙醇-鹽酸溶液的混合液兩種提取劑對齊墩果酸測定值的影響。結果表明,經甲醇-鹽酸溶液的混合液提取后,藜麥樣品提取液中雜質少,齊墩果酸分離效果好,測定值為2.99 g·kg－1,提取率高;而經乙醇-鹽酸混合液提取后,齊墩果酸的測定值在2.75 g·kg－1左右,提取率較低。因此,試驗選擇提取劑為甲醇-鹽酸溶液的混合液。

2.4 正交試驗

采用L9(34)正交試驗進一步優化水解條件,考察了水解時間(A)、鹽酸濃度(B)、甲醇體積分數(C)3個因素對齊墩果酸測定值的影響,每個因素選取3個水平,并添加空列來衡量試驗的可靠程度,結果見表1,并對優化出的組合進行加標回收試驗。

表1 正交試驗結果Tab.1 Results of orthogonal test

表1 (續)

結果表明,空列的極差較小,說明試驗設計合理。甲醇體積分數對齊墩果酸測定值的影響較大,其次是水解時間和鹽酸濃度,得出最優試驗組合為C3A1B2和C3A2B2。按試驗方法對兩種組合進行驗證,所得齊墩果酸的測定值分別為1.38,1.61 g·kg－1,可知當甲醇體積分數為80%,鹽酸濃度為3 mol·L－1,水解時間為1.5 h時,藜麥中齊墩果酸的測定值相對較高。綜上分析,試驗選擇以含3 mol·L－1鹽酸的80%甲醇溶液為提取劑,采用超聲-酸水解1.5 h的方式提取藜麥中的齊墩果酸。對優化出的試驗組合進行加標回收試驗,所得平均回收率為98.6%。

2.5 標準曲線與檢出限

按照試驗方法對齊墩果酸標準溶液系列進行測定,以齊墩果酸的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明,齊墩果酸的質量濃度在5～500 mg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程為y＝1.732×106x－6.272×103,相關系數為0.9994。

對0.02 mg·L－1齊墩果酸標準溶液進行測定,以3倍信噪比(S/N)作為檢出限(3S/N),10倍信噪比作為測定下限(10S/N),計算得齊墩果酸的檢出限為0.3 mg·kg－1,測定下限為1.0 mg·kg－1。

2.6 穩定性試驗

按照試驗方法,對放置0,2,4,6,8,12,24 h的藜麥樣品提取液進行測定,計算齊墩果酸保留時間及峰面積的相對標準偏差(RSD)。結果表明,齊墩果酸保留時間的RSD 為0.23%,峰面積的RSD 為3.9%,說明藜麥樣品提取液在24 h內穩定。

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法,對藜麥樣品進行低(50 mg·L－1)、中(100 mg·L－1)、高(200 mg·L－1)等3個濃度水平的加標回收試驗,計算回收率和測定值的RSD,以驗證方法的準確度和精密度,結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

結果顯示,齊墩果酸的回收率為98.0%～101%,RSD 為4.2%～7.5%,表明該方法的準確度高、精密度好,滿足分析要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對12個藜麥樣品進行測定,結果顯示,12個藜麥樣品中均檢出齊墩果酸,檢出量依次 為9.63,21.26,3.79,0.68,1.47,1.45,1.80,0.73,0.51,1.66,5.31,0.67 g·kg－1。

本工作以超聲-酸水解的方式提取樣品,建立了高效液相色譜法測定藜麥中齊墩果酸含量的方法。該方法簡單、快速,重現性和穩定性好,避免了分光光度法顏色干擾問題及強腐蝕試劑的使用,提高了分析的準確性。