丙烯酰胺對小鼠腸道屏障損傷作用

雷艾彤，蘇 丹，聶春超，郭子妍，元同驥，陳 奕

(南昌大學食品學院，江西 南昌 330047)

丙烯酰胺(Acrylamide,AA)是常見的工業助劑[1]，在化工、紡織、廢水處理、醫療美容等各行各業中均有普遍應用[2]。研究表明丙烯酰胺具有多種毒性，例如神經毒性[3]、遺傳毒性[4]、生殖毒性[5]、致癌性[6]、致畸性[7]等，并且可以在體內蓄毒，會引起急性、亞急性和慢性中毒[8]。自瑞典研究人員于2002年首次在油炸馬鈴薯中發現丙烯酰胺后，各國食品領域的研究者們陸續在食品中檢測到丙烯酰胺的存在，進一步證實了其在飲食中的暴露情況。研究表明，經高溫烹調的淀粉類食品中均含有丙烯酰胺，這主要是天冬門酰胺和還原糖美拉德反應的結果[9-10]。丙烯酰胺的日常暴露給對人類帶來了潛在的重大風險，同時也是食品安全研究人員亟待解決的重要命題。在1994年，丙烯酰胺被國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer,IARC)列為人類可能致癌物質(2A類)[11]。由于各地區飲食習慣以及生活環境差異，不同人群丙烯酰胺暴露情況差異較大[12-13]。我國在最新膳食研究中得出的丙烯酰胺日均攝入量為0.319 μg/(kg bw·d)[14-15]，顯著低于世界平均水平1 μg/(kg bw·d)[16]。目前大多數對于丙烯酰胺腸道屏障損傷的研究停留在體外實驗，體內研究還不夠深入[17-18]，對于不同劑量暴露下的損傷情況對比也鮮有報道。

本研究通過建立不同濃度下丙烯酰胺染毒模型，對不同暴露量下小鼠機體情況及腸道損傷程度進行對比。檢測不同劑量丙烯酰胺在氧化指標、組織結構、蛋白表達等層面對腸道屏障損傷的程度，評估丙烯酰胺劑量與腸道屏障損傷情況的關系。為后續研究丙烯酰胺的膳食預防和天然活性物質的毒性控制提供理論基礎和研究依據。

1 實驗方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺(純度>99.9%)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

雄性KM小鼠，5周齡，20.0±2.0g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(生產許可證號：SCXK(湘)2016-0002)。動物實驗均按南昌大學動物倫理評審委員會批準的程序和許可(SYKX-2015-0001)進行。

Anti-ZO1緊密連接蛋白抗體、Anti-Occludin抗體、Anti-Claudin 1抗體、Anti-MyD88抗體、Anti-TLR4抗體、Anti-NF-kB p65抗體均購于英國Abcam公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司。過氧化氫酶(Catalase，CAT)、微量還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)、D-乳酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所；BeyoECL Star(特超敏ECL化學發光試劑盒)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、BCA蛋白濃度試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；D-乳酸酶聯免疫吸附測定試劑盒購于武漢博士德公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

3K15高速臺式離心機(德國Sigma公司)、3001全波長掃描式多功能讀數多功能酶標儀(美國Thermo公司)、A10超純水儀(美國Millipore公司)、2HWY-2102生化培養箱(上海森信實驗儀器公司)、KZ-II組織破碎儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)、AL104型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)、RE-52AA旋蒸儀(上海亞榮生化儀器廠公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物模型的建立

選用KM小鼠，體重20.0±2.0 g，共計25只，在溫度25 ℃±2 ℃，濕度%的環境下，12/12 h晝夜循適應性靜養一周后，隨機分為正常組(C組)、低劑量組(L組)、中劑量組(M組)、高劑量組(H組)。正常組灌胃等體積生理鹽水；低劑量組灌胃濃度為10 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、中劑量組灌胃濃度為20 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液、高劑量組灌胃濃度為30 mg·kg-1·bw的丙烯酰胺水溶液。每天灌胃1次，持續30 d。末次灌胃24 h后對小鼠進行最后1次稱重，摘眼球取血后，頸椎脫臼處死。并立即解剖收集小腸等臟器，置于-80 ℃儲存。分組及模型建立如圖1所示：

圖1 動物模型建立

1.3.2 小鼠一般行為情況觀察

在實驗期間觀察并記錄小鼠每日精神狀態、行為表現、毛發光澤度、進食情況，有無死亡情況等，有明顯行為差異情況拍照記錄。

1.3.3 小鼠體重及肝臟指數的測定

靜養1周后，從第8天開始于每日灌胃前對小鼠進行稱重記錄，并將體重數據繪制成圖，觀察實驗期間小鼠體重變化情況。

將解剖分離的肝臟經生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干多余水分并稱重記錄。將肝臟重量(mg)與體重(g)的比值表示肝臟指數數值：器官指數=器官重量/小鼠體重。

1.3.4 小腸病理變化檢查

取小鼠小腸空腸部分約2 cm左右組織，于生理鹽水中輕輕漂洗，祛除表面血跡。放入10%中性福爾馬林溶液中固定。用石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(hematoxylineosin，HE)染色、馬松(Masson)染色，光鏡下觀察并拍照。

1.3.5 小腸組織氧化指標測定

稱取100 mg左右小腸組織，按照m:v=1:9的比例加入同等體積的生理鹽水，加入鋼珠后于60 Hz條件下破碎6 min，后于8 000 r·min-1，4 ℃條件下離心15 min。吸取組織上清液，參考說明書測定SOD、CAT、GSH和MDA含量。

SOD酶活力單位定義：在黃嘌呤氧化酶藕聯反應體系中抑制百分率為50%時反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。CAT酶活性單位定義：在25 ℃，pH=7.0的條件下，在1 min內可以催化分解1 μmol過氧化氫定義為一個酶活力單位(μnit)。

1.3.6 小腸通透性情況測定

血樣在室溫下靜置2 h，隨后在4 ℃，6 000 r·min-1條件下離心10 min，獲得血清。參考說明書步驟測定血清中D-乳酸含量。

1.3.7 緊密連接蛋白Western Blot的檢測

(1)提取組織樣品蛋白

稱取小腸組織50 mg按比例m:v=1:10加入500 μL IP裂解液，再加入比例為ip:PUSF=100:1的PMSF防止組織蛋白質被蛋白酶融解；

將裂解液的腸組織破碎器70 Hz 120 s進行破碎，4 ℃，10 000 r·min-1離心4 min。取400 μL上清液加入空白EP管內，按比例5:1加入80 μL 6x SDS蛋白上樣緩沖液；

金屬浴95 ℃，6 min后快速預冷放入-20 ℃冰箱儲存。

(2)制膠

表1 SDS-PAGE制膠配方

(3)上樣與電泳

S1:80 V,25 min; S2:120 V，1 h。

(4)轉膜與孵育

采用半干轉，將PVDF膜剪好后置甲醇中浸泡活化，按照濾紙PVDF膜-膠-濾紙，形成“三明治”結構轉膜后，在1%牛血清蛋白中，室溫封閉40 min。

孵育一抗：將PVDF膜分別孵育在配好的一抗工作液(一抗：TBST=1:1 000)中(或按照說明書要求)，4 ℃過夜(或按說明書要求)。次日回收一抗工作液，加入適量的TBST置搖床上洗膜，10～15 min/次，重復3次。

孵育二抗：將PVDF膜分別孵育在配好的二抗工作液(二抗：TBST=1:10 000)中，(注意不同的一抗對應的二抗)室溫搖床40 min(或1 h，看說明書具體要求)。加入適量的TBST，置搖床上洗膜，15 min/次，重復3次。

(5)顯影

將BeyoECL Star (特超敏ECL化學發光試劑盒)顯影A液：B液=1：1的比例配制ECL工作液，均勻加到PVDF膜上，置于BioRad凝膠成像系統中進行曝光。

1.4 數據處理與分析

所有數據采用SPSS 16.0軟件分析，并重復3次，結果以平均值±標準差來表示；采用Graph Pad Prism 6軟件作圖；采用單因素方差分析和Tukey’s多因素t檢驗進行方差分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與討論

2.1 小鼠一般表觀情況觀察及死亡率

在丙烯酰胺造模期間，高劑量組于第28天、第30天分別出現一只中毒死亡的小鼠，其余各組均無小鼠死亡。L組的小鼠在實驗全過程中并未出現明顯的異常行為；M組自染毒第22天、高劑量自染毒第15天起，出現聚團取暖、嗜睡怕冷、后肢乏力、尿量增多、暴躁易怒、毛發凌亂無光澤等現象。在造模后期，M、H組內癱瘓情況普遍，小鼠失去正常行動能力。這表明丙烯酰胺的蓄積毒性開始體現。有專家學者基于生理學毒性代謝動力學模型及非線性計量反應法神經毒性邊際劑量為40 μg/(kg bw·d)[19-20]，本實驗得出小鼠在20 mg·kg-1·bw劑量下持續染毒22 d、30 mg·kg-1·bw劑量下持續染毒15 d即出現明顯神經毒性癥狀。

2.2 不同濃度AA致小鼠體重變化及肝臟指數變化

如圖2所示，在實驗造模前所有小鼠經過7天靜養后，體重均為(31.0±2.0) g。在灌胃造模最初13 d內，所有組別的小鼠體重正常上升。在(13～20) d，3個丙烯酰胺組的體重上升趨勢較正常組稍有放緩。在20 d后，H組體重持續下降，在30 d時體重較正常組下降16.7%；L組和M組體重上升趨勢變化不明顯。表明在10 mg·kg-1.bw劑量下，30 d的實驗期間丙烯酰胺在小鼠體內的蓄積毒性在體重減少上體現并不明顯。在20和30 mg·kg-1·bw

天數/d圖2 不同劑量丙烯酰胺致小鼠體重變化情況

劑量下，分別于20和15 d有影響體重增長的情況出現，尤其在高劑量組小鼠的體重較正常生長趨勢下降十分顯著(P<0.05)。

肝臟是體內的重要解毒器官，因此肝臟也是丙烯酰胺重要的靶器官。前期研究也表明，丙烯酰胺會導致肝臟損傷，肝功能受損[21]。因此本實驗測定了小鼠的肝臟指數，結果如圖3所示。正常組小鼠的肝臟指數為51.3 mg·g-1，高于3個模型組，肝臟指數也隨著丙烯酰胺的濃度上升而下降，并且高劑量組肝臟指數較正常組顯著下降(P<0.05)，且觀察到肝臟組織顏色較正常組明顯加深、表面顆粒狀組織明顯。與前期研究觀察到丙烯酰胺致肝臟損傷的表觀情況一致[31]。表明10～30 mg·kg-1.bw的丙烯酰胺連續造模30 d均會造成肝臟損傷，不同程度的影響肝臟的組織結構。

AA/(mg·kg-1)#P<0.05,##P<0.01，下同。圖3 不同劑量丙烯酰胺致小鼠肝臟指數變化情況

2.3 不同濃度AA致小鼠小腸組織病理變化情況

小腸是機體中最重要的吸收器官之一，絨毛-隱窩軸作為腸黏膜的基本功能單位，腸絨毛的高度決定了小腸與營養物質的接觸面積。本實驗通過HE染色法觀察小鼠小腸組織結構形態，如圖4A所示，正常組的小腸絨毛排布整齊有序，規則清晰。而隨著丙烯酰胺濃度上升，各模型組小腸絨毛長度呈顯著下降。小腸絨毛排布混亂，且高劑量組上皮細胞邊界模糊，腸道機械屏障明顯受損。以上結果表明丙烯酰胺會對小腸上皮造成損傷，降低絨毛高度、加寬隱窩寬度，影響腸道正常組織結構，且呈劑量依賴性。通過Masson染色法觀察小鼠小腸組織的纖維化情況，結果由圖4B所示，但小腸組織纖維化并不明顯。以上結果表明，丙烯酰胺會明顯損傷腸黏膜組織結構，破壞小腸黏膜機械屏障，尚未觀察到明顯的纖維化病變。

2.4 不同濃度AA致小鼠小腸氧化損傷

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)屬

(A)組織形態觀察(200×)

(B)纖維化情況觀察(200×)圖4 不同濃度丙烯酰胺對小腸組織結構和纖維化影響

于內源性抗氧化酶，可以保護機體免受自由基的侵害，并且在對抗脂質過氧化和過氧化氫的有害生理效應中發揮重要作用[22]。還原型谷胱甘肽(GSH)是機體內最重要的非酶性抗氧化物，同時也是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的底物。SOD將ROS轉化為過氧化氫，然后CAT和GSH-Px將其降解為水和氧[23]。丙二醛(MDA)是一種脂質過氧化產物，也是反映生物體內氧化應激情況的重要生物標志物[24]。

如圖5所示，與正常組相比，各丙烯酰胺組中MDA含量均顯著(P<0.05)升高，高劑量組極顯著升高(P<0.01)。且經丙烯酰胺造模后，小腸組織中抗氧化酶CAT和SOD含量顯著降低(P<0.01)，抗氧化物GSH的含量也有不同程度降低，且高劑量組明顯低于另外兩個劑量組。這些結果表明，丙烯酰胺會造成小鼠小腸組織脂質過氧化，降低抗氧化酶活性，破壞正常體內的氧化還原系統，從而造成小鼠小腸氧化損傷。并且也有研究顯示丙烯酰胺會造成小鼠體內脂肪消化吸收相關通路標志蛋白的差異性表達，這與MDA的實驗結果相吻合，證明脂肪的代謝可能是丙烯酰胺造成小腸損傷的作用途徑之一[25]。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

2.5 不同濃度AA致小鼠腸道通透性變化

作為腸道中普遍的細菌發酵代謝產物，D-乳酸可由腸道中多種細菌形成[26-27]。在日常食物攝取后較少被吸收，且體內無法將其快速降解。腸道中的D-乳酸會在腸黏膜受損導致腸道通透性增加時進入血液，使血漿中D-乳酸水平升高[28]。因此，血液中的D-乳酸水平可以作為監測腸黏膜損害程度和通透性的指標。如圖6所示，丙烯酰胺造模后的各組血清中D-乳酸的含量較正常組均有上升，其中低劑量組上升差異性最為明顯。表明丙烯酰胺會增加腸黏膜的通透性，破壞小腸機械物理屏障功能，導致腸道內的細菌代謝產物透過腸黏膜進入血液中，造成血清內抗原含量上升，打破機體內原有的免疫平衡。而低劑量血清中D-乳酸水平高于中、高劑量組，猜測可能是由于丙烯酰胺改變了腸道中的腸道菌群組成，從而影響細菌產物，造成D-乳酸的生成量下降。

AA/(mg·kg-1)圖6 不同濃度丙烯酰胺致小鼠血清中D-乳酸含量的影響

2.6 不同濃度AA對小鼠腸道緊密連接蛋白的影響

緊密連接(Tight junction)蛋白是小腸細胞表達的一類與腸道通透性和機械屏障密不可分的蛋白，他們能夠通過建立固有層來有效抵御腸道內的毒素和微生物病原體等等[29]，這也是腸道保護中最重要的防御屏障。腸上皮細胞間主要通過緊密連接蛋白相連。因此緊密連接蛋白的表達情況能夠切實的表明腸道受損程度和通透性情況，當緊密連接蛋白的表達下降時，腸上皮細胞間的間隙會增大，腸道通透性會上升，此時表明腸黏膜受到破壞。因此其是評價腸道健康程度的重要指標和評價標準。緊密連接蛋白存在于上皮細胞的頂端，由跨膜蛋白和外周蛋白間相互作用而成，受多種機制共同調控。其中ZO家族是最主要的緊密連接蛋白家族[30]，而ZO-1是家族中維持細胞形態的重要組成部分，它可以與Occludin相結合確保腸上皮細胞的完整性和封閉性。

通過western blot手段對各組間Claudin、Occludin及ZO-1緊密連接蛋白的表達進行檢測。可以通過圖7看到，丙烯酰胺誘導后，各組中3種緊密連接蛋白的表達都有顯著下降，并且下降程度和丙烯酰胺濃度呈正相關。這表明丙烯酰胺濃度越高，給小鼠小腸造成的損傷越嚴重，這與3.3中小腸組織切片結果一致。表明丙烯酰胺產生的體內毒性會降低小腸組織中緊密連接蛋白的表達，通過影響緊密連接蛋白的方式增大上皮細胞間間隙，造成腸道通透性升高，損傷小腸機械屏障。后續可能會造成腸道內的病原體進入體液循壞，打破體內免疫平衡。

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)

AA/(mg·kg-1)圖7 不同濃度丙烯酰胺致小鼠腸組織緊密連接蛋白的影響

3 結論

綜上所述，本研究發現10～30 mg·kg-1·bw劑量范圍內丙烯酰胺連續灌胃30 d均會對小鼠小腸造成不同程度的損傷。當日劑量達到30 mg·kg-1·bw時，連續灌胃30 d，會造成小鼠體重明顯下降，全部出現后肢癱瘓等癥狀，甚至有死亡情況。此外，丙烯酰胺會破壞機體內抗氧化平衡，丙烯酰胺染毒后小腸組織出現明顯病理損傷，絨毛長度變短、排列雜亂，但尚未造成明顯腸道纖維化病變。并且會通過降低緊密連接蛋白的表達造成腸黏膜上皮細胞間隙變大，增加腸道通透性，造成腸道機械屏障損傷。還會導致腸道內微生物產物進入體液循環中，破壞體內免疫平衡。以上研究表明高于10 mg·kg-1·bw劑量單位的丙烯酰胺持續攝入30 d后均會造成小鼠小腸屏障損傷。