基于轉(zhuǎn)錄組分析不同溫度下池蝶蚌性別相關(guān)基因的表達(dá)

曾 起，胡蓓娟，徐紅琴，洪一江*

(南昌大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院;b.江西省水產(chǎn)動(dòng)物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330031)

池蝶蚌是中國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖珍珠蚌之一，因育珠能力強(qiáng)，產(chǎn)出珍珠具備粒徑大，光澤度好和品相佳等特點(diǎn)，養(yǎng)殖規(guī)模迅速擴(kuò)大，成為了我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝類，應(yīng)用前景非常巨大[1]。內(nèi)臟團(tuán)作為培育珍珠的重要部位，其產(chǎn)出的珍珠光澤好，顆粒大和形狀圓[2]，其中性腺是很重要的因素。

蔡英亞等[3]闡明，產(chǎn)在丹麥的食用牡蠣的性別比例會(huì)隨著水溫變化而發(fā)生改變，當(dāng)生存環(huán)境的水溫高時(shí)，其雌性個(gè)體數(shù)量處于優(yōu)勢(shì)地位，反之，雄性個(gè)體數(shù)量占優(yōu)。金啟增等[4]闡述馬氏珠母貝在培養(yǎng)過(guò)程中水溫升高會(huì)導(dǎo)致雌貝的數(shù)量占比增加；反之，雄貝占比增加。據(jù)觀察，水溫與貝類性別的轉(zhuǎn)變有著很重要的關(guān)系，當(dāng)水平處于13.2 ℃～19.9 ℃時(shí)，雄性個(gè)體占比高；當(dāng)水溫在20 ℃～29.3 ℃時(shí)，雌性個(gè)體和雄性個(gè)體占比幾乎相等；但水溫再次降低時(shí)，雄性個(gè)體的數(shù)目又會(huì)重新增加。這表明，水溫低，雄性貝數(shù)量上是占優(yōu)勢(shì)的。Zapata等人[5]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲牡蠣配子的發(fā)生和性別決定主要受到溫度影響，類固醇不會(huì)作為內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子參與性別發(fā)育，而海水溫度的上升和氣候的變暖，可能導(dǎo)致其自然種群中的性別比例傾斜。

最近的研究表明，某些基因會(huì)影響牡蠣或淡水貽貝的性別決定和分化。Teaniniuraitemoana等[6]采集了不同發(fā)育階段的雌性珠母貝和雄性珠母貝樣本，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了其性別決定和性別分化基因，例如影響雄性分化的dmrt和fem1，以及影響雌性發(fā)育的foxl2和vit。Zhou等[7]利用了WCGNA(加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析)方法，篩選了扇貝性別分化和決定的關(guān)鍵基因，并構(gòu)建扇貝性別確定和分化的途徑。在這一途徑中，dmrt1具有主導(dǎo)功能。Wang等[8]報(bào)道foxl2在三角帆蚌的性別分化中起關(guān)鍵作用，而β-catenin[9]在免疫反應(yīng)和性別決定中起關(guān)鍵作用。此外，Hashiyama[10]僅在XX型果蠅性腺的原始生殖細(xì)胞中檢測(cè)到sxl的表達(dá)。

貝類性腺發(fā)育過(guò)程中，發(fā)生了一定程度的性逆轉(zhuǎn)或者雌性同體的出現(xiàn)。例如，一些珠母貝在受到溫度或者其他因素影響時(shí)，在生存過(guò)程中表現(xiàn)出連續(xù)性的性別逆轉(zhuǎn)[11]；Christelle[12]通過(guò)不同溫度的養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)牡蠣存在性別逆轉(zhuǎn)和雌雄同體現(xiàn)象，并伴隨著性別決定相關(guān)基因表達(dá)的變化；Wu等[13]在研究池蝶蚌發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)26～32月齡存在雌性同體現(xiàn)象。因此，為了探究溫度對(duì)其性別分化和和性腺發(fā)育的影響，本研究采用不同養(yǎng)殖溫度下的池蝶蚌為原材料，并采用Pacbio三代測(cè)序技術(shù)和Illumina二代測(cè)序技術(shù)對(duì)雌雄蚌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)差異基因探究池蝶蚌性腺發(fā)育和性別分化的原因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

池蝶蚌取自于江西省撫州市池蝶蚌良種場(chǎng)。挑選無(wú)插核、健康的29月齡池蝶蚌共50只,放置在充分曝氣的養(yǎng)殖箱進(jìn)行暫養(yǎng)。1周后，各取雌雄蚌5只作為一組，共分5組，分別在15 ℃，20 ℃，25 ℃，30 ℃和33 ℃下進(jìn)行為期2周的養(yǎng)殖試驗(yàn)。養(yǎng)殖結(jié)束后，每個(gè)溫度組各取3只雌蚌和雄蚌性腺混樣，進(jìn)行二代RNA測(cè)序；另取常溫下(23 ℃)暫養(yǎng)的雌雄蚌性腺作為對(duì)照進(jìn)行三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，性腺樣品液氮速凍，隨后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

總RNA的提取，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)為Illunima Hiseq 2500，三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)為Pacbio Sequel。

1.2.3 基因表達(dá)水平分析

利用CD-HIT軟件將雌雄蚌轉(zhuǎn)錄本合并去冗余后，得到的轉(zhuǎn)錄本作為參考序列，使用bowtie2軟件將clean data比對(duì)到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，并通過(guò)RSEM軟件獲得單個(gè)樣品中每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的reads數(shù)量。考慮到序列深度和基因長(zhǎng)度對(duì)片段的影響，并將所有reads計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為FPKM，以將FPKM大于0.3的相對(duì)水平定義為顯著表達(dá)基因，并用其做基因表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)。FPKM計(jì)算公式如下：

注：Xi:單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀取數(shù);Li:轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度；N:轉(zhuǎn)錄本的讀取總數(shù)。

1.2.4 基因差異表達(dá)分析和聚類分析

實(shí)驗(yàn)采用了DEseq2 R包分析有重復(fù)組的數(shù)據(jù)，對(duì)各個(gè)溫度下雌雄之間進(jìn)行差異表達(dá)分析。其中將差異倍數(shù)(FoldChange)大于2及調(diào)整后的p值(padj)小于0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選符合條件的基因作為差異表達(dá)基因。FoldChange是兩個(gè)樣品間某一轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的比值，padj是通過(guò)對(duì)p值進(jìn)行校正后得到的以不同實(shí)驗(yàn)條件下的差異基因的FPKM值為表達(dá)水平，做層次聚類分析。

1.2.5 差異表達(dá)基因功能注釋

使用NT，NR，Swiss-Prot，KEGG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋。

1.2.6 差異基因功能富集分析

差異表達(dá)基因的功能富集分析主要包括GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析和KEGG富集分析是通過(guò)clusterProfiler R包完成。

1.2.7 qRT-PCR定量驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇了6個(gè)差異表達(dá)基因的mRNA進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR引物設(shè)計(jì)使用Oligo7.0工具完成，引物序列由北京擎科生物公司合成，具體引物見表1。β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法定量，每個(gè)樣本每個(gè)基因進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 qRT-PCR選用基因及引物序列

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果與序列分析

PacBio單分子熒光測(cè)序?yàn)榄h(huán)狀測(cè)序，測(cè)序過(guò)程的單分子產(chǎn)出的有效片段為Subreads，經(jīng)過(guò)自我矯正和去冗余后，獲得雌雄全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)目分別為96 867和111 520條，平均長(zhǎng)度分別為4 095和3 876 bp，主要分布在2.5～3.5 kbp之間(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)定量

將clean data的reads比對(duì)到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本上發(fā)現(xiàn)，雌性性腺轉(zhuǎn)錄本比對(duì)上的序列在88%左右，雄性性腺轉(zhuǎn)錄本比對(duì)上的序列在75%左右，雌性轉(zhuǎn)錄本比對(duì)上數(shù)目多于雄性轉(zhuǎn)錄本。用FPKM統(tǒng)計(jì)不同表達(dá)水平下基因的數(shù)量以及單個(gè)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在所有轉(zhuǎn)錄組中，F(xiàn)PKM分布最多的在0～1之間，占了50%左右，其中FPKM>5的大約占25%圖2(A)。為了直觀的比較各樣本整體的表達(dá)水平，以及對(duì)每個(gè)處理溫度組表達(dá)水平的離散程度，采用箱線圖展示FPKM的分布顯示10個(gè)組樣本表達(dá)水平整體上一致，其中雌性25 ℃處理組樣本表達(dá)水平略低，雌性30 ℃處理組表達(dá)水平略高圖2(B)。

轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度

轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度圖1 轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布圖

2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

采用DEseq2分析鑒定5個(gè)溫度下不同性別處理組間的差異表達(dá)基因，在15 ℃雌雄比較組至33 ℃雌雄比較組中，分別檢測(cè)到6 311，3 013，6 673，6 798，5 685個(gè)差異表達(dá)基因(表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌雄之間的差異基因非常豐富。在20 ℃和33 ℃時(shí)差異基因數(shù)量比其它組更少，15 ℃時(shí)雌雄對(duì)比組含3 013個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 045個(gè)基因上調(diào)，1 968個(gè)基因下調(diào)；33 ℃對(duì)比組含5 703個(gè)差異表達(dá)基因，2426個(gè)上調(diào)，3277下調(diào)。在5個(gè)處理組中，共有17696條轉(zhuǎn)錄本在所有組間表達(dá)。用層次聚類分析5個(gè)溫度脅迫處理組間差異表達(dá)基因的分布情況發(fā)現(xiàn)，雌蚌組與雄蚌組具有類似的表達(dá)情況，其中15 ℃和20 ℃聚為一支，25 ℃，30 ℃和33 ℃聚為一支(圖3)。

(A) 不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖

(B) 基因表達(dá)水平對(duì)比圖圖2

2.4 不同溫度下差異基因的KEGG富集

差異基因的富集分析是通過(guò)超幾何分布，其富集分析以通路為單位，將轉(zhuǎn)錄本中的基因作為背景，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路。在所有富集中，均展現(xiàn)富集程度最高的前20個(gè)通路。對(duì)5個(gè)不同溫度下雌雄間所鑒定到的6311，3013，6673，6798和5685個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG注釋，分別完成4585，2203，4896，4932和4069個(gè)。其中在15 ℃組，腎素分泌(ko04924)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(ko00260)，淀粉和蔗糖代謝(ko00500)顯著富集等；在20 ℃組中，顯著富集的有卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(ko04114)，MAPK信號(hào)通路(ko04016)，醛固酮合成與分泌(ko04925)和GnRH信號(hào)傳導(dǎo)途徑(ko04912)等，腎素分泌(ko04924)及磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(ko04070)也被顯著富集；在25 ℃情況下，主要富集到卵母細(xì)胞減數(shù)分裂(ko04114)，細(xì)胞周期(ko04110)和Notch信號(hào)通路和腎素分泌(ko04924)等；在30 ℃的時(shí)，富集到細(xì)胞周期(ko04110)，細(xì)胞周期-酵母(ko04111)和孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟(ko04914)。33 ℃時(shí)，可以看出顯著富集的包括丙酮酸代謝(ko00620)，腎素分泌(ko04924)，胰高血糖素信號(hào)通路(ko04922)。KEGG富集顯示在各溫度的處理組均含有卵母細(xì)胞分裂，但是在20 ℃和25 ℃的時(shí)呈現(xiàn)出顯著富集(qvalue<0.05)；在30 ℃出現(xiàn)了孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟；在25 ℃的時(shí)候開始具有細(xì)胞周期。

表2 相同溫度下雌雄性腺之間的差異基因結(jié)果

注：聚類分析圖，將log10(FPKM+1)值進(jìn)行歸一化轉(zhuǎn)換并進(jìn)行聚類，深色表示高表達(dá)，淺色表示低表達(dá)。顏色從深到淺，表示log10(FPKM+1)從大到小。

2.5 差異基因中性別相關(guān)基因的篩選和分析

對(duì)5個(gè)溫度處理組之間的差異表達(dá)基因的進(jìn)行組間比較，維恩圖有802個(gè)差異表達(dá)基因在5個(gè)對(duì)比組中重疊(見圖5)。其中共上調(diào)的基因?yàn)?19個(gè)數(shù)，共下調(diào)的基因個(gè)數(shù)為483個(gè)。將5個(gè)組共表達(dá)差異的差異基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，下調(diào)基因的GO富集顯示在幾丁質(zhì)的結(jié)合，幾丁質(zhì)代謝過(guò)程和蛋白結(jié)合，鈣離子的結(jié)合，細(xì)胞外區(qū)域，膜，胞外空間上，這些均與與珍珠質(zhì)的分泌和形成有關(guān)；上調(diào)基因的GO富集顯示在蛋白質(zhì)結(jié)合，ATP的結(jié)合和酶的活動(dòng)等，這些與精子的生成和活動(dòng)有關(guān)(見圖6)。

注：A：15 ℃；B：20 ℃；C：25 ℃；D：30 ℃；E：33 ℃。圖4 各個(gè)溫度下差異基因KEGG富集結(jié)果

2.6 差異基因中性別相關(guān)基因的篩選和分析

在差異表達(dá)基因中篩選出大量卵巢發(fā)生相關(guān)基因，其中包括中蛋黃鐵蛋白(FRIY)，卵黃囊蛋白(SIAE)，核黃素結(jié)合蛋白(RBP)，卵黃囊衍生的胚胎大分子(ELYS)等，還有卵細(xì)胞發(fā)生相關(guān)基因，包括卵母細(xì)胞表達(dá)核仁蛋白(ANO39)，卵母細(xì)胞成熟因子(MOS)，卵母細(xì)胞特異性母體影響因子(ZAR1)和卵黃原蛋白(VIT)等。

在差異表達(dá)基因中鑒別到大量精子發(fā)生相關(guān)基因，精子發(fā)生相關(guān)蛋白4，7，17，22(spat4，spat7，spt17，spt22)，精子發(fā)生和中心粒相關(guān)蛋白1(sper1)和精子特異性接頭組蛋白H1樣蛋白(HILS1)；精子運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白精子鞭毛蛋白1、2(spef1，spef2)，精子表面蛋白17(sp17)等；還發(fā)現(xiàn)大量精巢相關(guān)基因，例如，睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2(TSSK2)，T復(fù)合物睪丸表達(dá)蛋白1(Tcte-1)和精巢表達(dá)蛋白10，11，30(Tex10，Tex11，Tex30)等。

注：m15 vs f15:在15 ℃下雄雌間差異基因的數(shù)量，其他類似。

注：A:上調(diào)差異表達(dá)基因的GO富集；B:下調(diào)差異表達(dá)基因的GO富集。

為了進(jìn)一步探究性別決定和性別分化，從各個(gè)組間中挑選出差異基因，列出出部分性別決定和性別分化相關(guān)基因如表4.7，其中sox2，wnt4，fem1，rspo1，vit在5個(gè)溫度對(duì)比組均顯著表達(dá)差異，但是sox5，sox9和folx2在20 ℃時(shí)沒有表達(dá)差異。其中tra1,wnt4，fem1，rspo1，sox9和folx2等，文獻(xiàn)記載它們與性別決定和性別分化有關(guān)。

表3 差異基因中性別決定基因的篩選

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證分析

隨機(jī)挑選了6個(gè)差異表達(dá)基因pif，tex43，wnt4，rsop1，tra1和fem1，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。其中wnt4，rspo1，pif，calm在雌性中顯著表達(dá)(P<0.05，log2FC<-1)，tra1和fem1在雄性中顯著表達(dá)(P<0.05，log2FC>1)。通過(guò)qRT-PCT進(jìn)行驗(yàn)證，篩選的6個(gè)基因雌雄間表達(dá)差異極顯著(P<0.01)，且差異表達(dá)基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的表達(dá)量變化倍數(shù)趨勢(shì)基本一致(圖7)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組結(jié)果可靠，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)池蝶蚌雌雄株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及篩選與性別相關(guān)的差異基因是可行的。根據(jù)熒光定量結(jié)果，fem1,tra1,rspo1和wnt4的mRNA表達(dá)水平如圖8，在雌蚌中fem1在15 ℃和20 ℃時(shí)高于其他水平；在雌蚌和雄蚌中rspo1和tra1在15 ℃和20 ℃時(shí)均低于其他溫度水平；在雌蚌中wnt4在25 ℃時(shí)表達(dá)量最高。

3 討論

SMRT測(cè)序技術(shù)可以提升無(wú)參轉(zhuǎn)錄組的組裝效果[14]。在這項(xiàng)研究中，我們首次采用RNA-seq和SMRT測(cè)序結(jié)合的方式，生成了池蝶蚌全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)分析后獲得了96 867和111 520個(gè)高質(zhì)量的全長(zhǎng)序列。在這項(xiàng)研究中，我們首次采用RNA-seq和SMRT測(cè)序結(jié)合的方式，生成了池蝶蚌全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)分析后獲得了96867和111520個(gè)高質(zhì)量的全長(zhǎng)序列，為無(wú)需PCR的基因結(jié)構(gòu)探索和遺傳功能探究提供了寶貴數(shù)據(jù)。與之前使用Illumina平臺(tái)的池蝶蚌轉(zhuǎn)錄組研究相比[15]，二代的雌雄轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度分別為484和472 bp，而本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)達(dá)4 095和3 876 bp。研究調(diào)查了5個(gè)不同溫度下池蝶蚌雌雄性腺的基因表達(dá)。對(duì)差異表達(dá)基因研究發(fā)現(xiàn)，在20 ℃和33 ℃的時(shí)候，差異基因數(shù)量最少，推測(cè)這兩個(gè)溫度下雌雄表達(dá)差異比其他組小。各雌雄對(duì)比組只有802個(gè)基因在各個(gè)溫度下以不同方式共同表達(dá)。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，25 ℃時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞周期通路，說(shuō)明細(xì)胞活動(dòng)相對(duì)開始活躍；同時(shí)雌性個(gè)體生殖相關(guān)的活動(dòng)變得活躍起來(lái)，在25 ℃時(shí)出現(xiàn)卵母細(xì)胞減速分裂通路和notch信號(hào)通路等。KEGG表明25 ℃時(shí)，雌性相關(guān)活動(dòng)更加活躍，有利于雌性生長(zhǎng)發(fā)育。

注：Log2FC:雄雌之間的差異倍數(shù)。圖7 qRT-PCR定量結(jié)果

注：fem1，tra1基因在15 ℃下雌蚌性腺中的表達(dá)量分別定義1;rspo1，wnt4基因在15 ℃下雄蚌性腺中的表達(dá)量分別定義1;**表示P<0.01。

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，wnt4，rspo1，fem1和tra1等4個(gè)性別決定或性別分化基因在不同溫度下的池蝶蚌性腺中始終出現(xiàn)差異。wnt4和rsop1的表達(dá)量雌性高于雄性，fem1和tra1的表達(dá)量雄性高于雌性。wnt4是性別決定基因，且在雌雄哺乳動(dòng)物的形態(tài)發(fā)育中起到關(guān)鍵的作用[16]。小鼠性別決定前的性腺中wnt4存在表達(dá)，性別分化后在卵巢中仍持續(xù)表達(dá)，但精巢中的表達(dá)顯著下降[17]。李海龍等人[18]研究發(fā)現(xiàn)wnt4在櫛孔扇貝的性腺發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均存在表達(dá)，尤其成熟性腺表達(dá)最高，推測(cè)其在性腺生殖細(xì)胞成熟的整個(gè)過(guò)程中起著不可忽視的作用。Rspo1在雌性性別決定通路上游發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)能啟動(dòng)wnt/β-catenin通路，對(duì)雌性卵巢的分化是不可或缺的，另外，rspo1能促進(jìn)卵巢發(fā)育并抑制精巢發(fā)育[19]。在青鳉中研究發(fā)現(xiàn)rspo1基因激活的通路，對(duì)雌性卵巢的分化是不可或缺的[20]，rspo1在青鳉雄性胚胎中過(guò)表達(dá)能夠引起完全的性逆轉(zhuǎn)(雄轉(zhuǎn)雌)，證明rspo1通路在青鳉雌性卵巢發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在線蟲中，fem1是雄性個(gè)體發(fā)育，以及雄性和雌雄同體精子發(fā)生所必須的[21]，它可以通過(guò)阻止tra1的作用，從促進(jìn)雄性發(fā)育產(chǎn)生。Doniach等[22]發(fā)現(xiàn)在櫛孔扇貝中，fem1只在成熟的雄性個(gè)體內(nèi)表達(dá)，而不是雌性或者雌雄同體內(nèi)，表明fem1在維持雄性化可能發(fā)揮作用。周祖陽(yáng)等[23]在長(zhǎng)牡蠣中成功克隆出fem1，并對(duì)長(zhǎng)牡蠣各個(gè)發(fā)育時(shí)期的fem1進(jìn)行表達(dá)分析，推測(cè)其參與了性別決定和性別分化的過(guò)程。fem1，rspo1和wnt4的qRT-PCR與轉(zhuǎn)錄測(cè)序的表達(dá)量變化倍數(shù)一致，且rspo1和wnt4在雌性中的表達(dá)水平高于雄性，而fem1在雄性中的表達(dá)水平高于雌性。推測(cè)fem1，rspo1和wnt4在性別調(diào)控中發(fā)揮作用，rspo1和wnt4在維持雌性化發(fā)生作用，而fem1在維持雄性化發(fā)揮作用。

Berkseth等[24]表明tra1在發(fā)育過(guò)程中通過(guò)參與阻止與雄性發(fā)育的基因來(lái)促進(jìn)雌性發(fā)育方面有普遍作用。Ronald[25]總結(jié)出tra1可以被視為是雌性動(dòng)物中的一種阻遏物，它可以關(guān)閉雄性相關(guān)基因然后發(fā)育成雌性。在此次研究中，通過(guò)差異基因分析發(fā)現(xiàn)，tra1在雄性中顯著表達(dá)，而且熒光定量結(jié)果分析也顯示tra1表達(dá)量在雄性中高于雌性。Wu等[13]發(fā)現(xiàn)池蝶蚌在26～32月齡時(shí)，出現(xiàn)雌雄同體的現(xiàn)象，且大部分的雌性同體蚌從雄蚌中發(fā)育而來(lái)。此次研究的池蝶蚌處于30月齡，推測(cè)tra1的出現(xiàn)，可能關(guān)閉池蝶蚌雄性相關(guān)基因，進(jìn)而產(chǎn)生雌雄同體的現(xiàn)象。熒光定量結(jié)果顯示，25 ℃以上時(shí)，tra1的表達(dá)量高于10 ℃和15 ℃水平，溫度的升高，可能進(jìn)一步促進(jìn)池蝶蚌雌雄同體的形成。

Holleley等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)孵化溫度在22 ℃～32 ℃之間時(shí)，鬃獅蜥由性染色體決定性別；當(dāng)溫度超過(guò)32 ℃時(shí)，后代中雌性的比例越來(lái)越高。Weber C和Zhou等[27]在巴西紅耳龜中發(fā)現(xiàn)，早期的原始性腺在31 ℃時(shí)分化為卵巢，在26 ℃時(shí)分化為精巢。在具有溫度依賴性性別決定的紅耳龜中，rspo1的上調(diào)發(fā)生在溫度敏感期，即性腺的發(fā)育受到某個(gè)特定溫度的影響。因此，rspo1表達(dá)是對(duì)溫度敏感的，并且在處于胚胎從雌性轉(zhuǎn)變?yōu)樾坌缘姆趸瘻囟葧r(shí)，rspo1基因就會(huì)下調(diào)[28]。熒光定量結(jié)果表明，rspo1在15 ℃和20 ℃時(shí)，雌蚌和雄蚌中表達(dá)量較25 ℃，30 ℃和33 ℃下顯著(P<0.01)降低，而推測(cè)在15 ℃和20 ℃溫度下有利于雄性的發(fā)育；雌蚌中的wnt4在25 ℃時(shí)表達(dá)量最高，而在雄蚌中的wnt4隨著溫度升高而升高；雌蚌中的fem1在25 ℃之后表達(dá)量出現(xiàn)顯著(P<0.01)降低，而雄蚌中的fem1受溫度影響不大。

綜上，根據(jù)KEGG富集分析和rspo1，wnt4，tra1和fem1的表達(dá)情況判斷，推測(cè)25 ℃以上的溫度，適合雌性的生殖發(fā)育。本研究為探索池蝶蚌的性別分化和性腺發(fā)育做出一定的參考，關(guān)于溫度對(duì)池蝶蚌性腺發(fā)育和性別分化的影響，還涉及諸多基因與其產(chǎn)物之間的相互作用，依然有待進(jìn)一步的深入發(fā)掘和探索。