原子熒光光譜法測定中華絨螯蟹中四種砷形態

高鈺一，崔琴，吳蓓琦，譚秀慧，任娣，王鷺，張秋云，陳風蔚

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

砷（As），具有較強的毒性和致癌性[1]，可通過食物鏈進入人體，對人體呼吸系統、生殖系統、免疫系統等造成損害[2-3]，被國際癌癥研究中心（IARC）劃分為Ⅰ類致癌物。水產品是人體攝入As的重要來源[4]，水產品中砷已引起研究者的廣泛關注[5-6]。研究表明，As元素毒性不僅與元素總量相關，而且與其存在形態密切相關，無機As的毒性大于有機As，并且三價砷[As（III）]的毒性大于五價砷[As（V）][7-8]?！妒称钒踩珖覙藴?食品中污染物限量》（GB 2762—2017）規定，水產動物及其制品中無機As（以As計）限量為0.5 mg/kg，當總As水平不超過無機As限量值時，不必測定無機As；否則，需再測定無機As。陳風蔚等[9]對江蘇地區市售中華絨螯蟹總As進行了測定，質量比為0.027～1.305 mg/kg。劉香麗等[10]對安徽養殖中華絨螯蟹總As含量進行調查，其質量比為0.073～1.433 mg/kg。這說明，部分中華絨螯蟹樣品總As水平已經超過無機As限量值，因此，有必要對As的形態進行進一步分析。

目前，As形態分析中，常用的分析方法有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICPMS）[11-12]、高效液相色譜-電感耦合等離子體發射光譜（HPLC-ICP-AES）[13]、高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜（HPLC-HG-AFS）[6，14]、高效液相色譜-氫化物發生-原子吸收光譜（HPLCHG-AAS）[15]等。其中液相色譜-原子熒光光譜（LC-AFS）操作簡單、運行成本低，并且有較高的靈敏度，易于在普通實驗室應用，適合中華絨螯蟹中砷形態的檢測。

現有水產品中As形態分析方法大多耗時較長，使用梯度洗脫進行液相色譜分離，操作較為復雜。現探索比較了不同提取劑對As化合物的提取效果，以及不同流動相下As化合物的分離效果，確定了適合中華絨螯蟹中As形態分析的檢測方法，旨在為中華絨螯蟹食用安全性評價提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-AFS-6500液相色譜-原子熒光光譜（北京海光儀器有限公司）；Hamilton PRP-X100陰離子分析柱（250 mm×4 mm，10μm）；MP225 pH計（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q Integral 5超純水儀（美國Millipore公司）；DK-8D數顯恒溫水浴鍋（華普達儀器制造廠）；Allegra 64R臺式超速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合儀（美國Scientific Industries公司）；TE612-L電子天平（德國Sartorius公司）。

As標準儲備液：亞砷酸根As（III）（GBW08666）、一甲基砷（MMA）（GBW08668）、二甲基砷（DMA）（GBW08669）、砷酸根As（V）（GBW08667）均購于國家標準物質研究中心。其他試劑均為分析純及以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 中華絨螯蟹去殼去鰓后，取可食部分，用高速萬能試樣粉碎機打成勻漿。

1.2.2 樣品前處理 稱取約1.000 g樣品，置于50 mL塑料離心管中，加入25 mL 0.15 mmol/L硝酸溶液，放置過夜。90℃熱浸提2.5 h，冷卻后取上層清液5 mL，加入5 mL正己烷，渦旋混勻后，以8 000 r/min轉速于4℃離心10 min，棄去上層正己烷，重復2次。取下層清液過0.45μm有機濾膜，待測。

1.3 儀器工作條件

液相條件：流動相為5 mmol/L磷酸氫二鈉和45 mmol/L磷酸二氫鉀溶液，等度洗脫，流量1 mL/min，柱溫20℃，進樣體積100μL。

原子熒光光譜儀條件：還原劑為20 g/L硼氫化鉀和5 g/L氫氧化鈉混合溶液；載流為5%鹽酸；主電流：80 mA；輔助電流：40 mA；載氣流量：300 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；蠕動泵轉速：60 r/min；原子化器高度：8 mm；數據采集頻率：10 Hz。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

As提取溶劑主要有水[16]、甲醇溶液[17]、硝酸溶液[18]等，試驗對比了純水、50%甲醇、0.15 mmol/L硝酸溶液的提取效果，結果發現，純水提取效率最低；甲醇溶液會導致無機砷峰形拖尾；硝酸溶液提取效果、效率均最高，且峰形對稱、尖銳。選取0.15 mmol/L硝酸溶液作為提取劑。

2.2 色譜分離條件的選擇

2.2.1 色譜柱 As形態的分離一般可以采用離子交換色譜、離子對色譜、反相離子對色譜等液相色譜與電感耦合等離子體質譜聯用。該試驗研究的As（III）、DMA、MMA和As（V）4種As化合物都是弱酸或中強酸，在適宜pH值水溶液中均以陰離子形式存在，故試驗選取Hamilton PRP-X100陰離子交換柱對4種As形態進行分離。待分析陰離子被淋洗液帶入色譜柱后，與功能基結合，在淋洗液的不斷洗脫下，離子又被洗脫下來，不同離子與功能基結合的時間長短不一樣，基于此原理，各離子得到分離。

2.2.2 流動相 As形態分析常采用緩沖鹽作為流動相[19]，試驗選用磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀溶液為流動相進行洗脫。該試驗考察了流動相濃度和pH值對色譜分離效果的影響。結果顯示，5 mmol/L磷酸氫二鈉和45 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液作為流動相，用10%磷酸調節pH值為5.92，采用等度洗脫，4種As形態在短時間內能夠實現分離，且分離效果最好。在該流動相條件下，4種As形態均以陰離子形式存在，與離子交換劑基團發生作用，按照與基團之間相互作用力的大小，以As（III）、DMA、MMA和As（V）的順序被洗脫下來，4種As形態完全分離，峰形對稱，尖銳。4種As形態的空白樣品色譜圖見圖1，標準色譜圖見圖2。

圖1 空白樣品色譜圖

圖2 4種As形態標準溶液色譜圖

2.3 線性范圍及檢出限

砷混合標準溶液分別配制成0，10，20，40，80和100μg/L，上機測定。以各定量離子色譜的峰面積（Y）對濃度（x）進行線性回歸。結果表明，在試驗標準濃度范圍內，各種As化合物線性回歸方程相關系數均在0.999以上。回歸方程及檢出限見表1，該方法檢出限小于《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》（GB 5009.11—2014）中水產動物的方法檢出限0.03 mg/kg，能夠滿足水產品中砷形態的檢測要求。

表1 線性曲線方程、線性范圍、相關系數及檢出限

2.4 精密度與加標回收率

選擇中華絨螯蟹樣品（四種As形態含量均低于檢出限），進行加標試驗，加標水平分別為0.05，0.10和0.25 mg/kg，按試驗方法每個加標濃度平行測定6次，結果見表2。各樣品中四種As形態的加標回收率和RSD分別為As（III）：86.1%～93.4%，1.78%～4.25%；DMA：97.1%～99.5%，1.41%～3.65%；MMA：88.4%～95.7%，1.21%～3.32%；As（V）：93.3%～97.3%，1.55%～2.59%。方法具有較好的精密度和準確度。

表2 加標回收率試驗結果①（n=6）

3 結論

該研究采用優化的試驗條件對市售中華絨螯蟹40個樣品進行了檢測。測定結果顯示，少數樣品檢出少量的As（III）。說明雖然中華絨螯蟹中總As含量較高，但毒性較大的無機As含量均小于0.5 mg/kg，納入研究的樣本符合食品安全國家標準要求。