結核分枝桿菌的耐藥機制研究進展

鄭 偉，田 甜，王 琦，刁乃超，李健明，時 坤，杜 銳，3，4

結核病(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)通過氣溶膠或飛沫進行傳播引起的[1]，是威脅人類健康的世界三大傳染病之一。M.tb主要侵襲宿主的肺部，形成肺結核，同時在腦膜，腸和腹膜等部位也會引起繼發感染[2]。研究表明艾滋病(AIDS)和結核病同時感染免疫力低下的群體，會帶來更嚴重的危害如高死亡率[3]。世界衛生組織公布的2020年結核病報告中指出， 2019年全球新發結核病患者約有996萬，中國新發結核病患者約有83.3萬,中國與印度和俄羅斯聯邦同為三大結核病高發國家[4]。為解決結核病給世界帶來的健康危害，20世紀七八十年代許多科學家進行了抗結核藥物的臨床研究。目前常用的一線抗結核藥物有異煙肼、利福平和已胺丁醇等，二線抗結核藥物有氟諾喹酮類、阿米卡星和卡那霉素等，研發的新藥有利奈唑胺、貝達喹啉和德拉馬尼等。但因抗結核藥物的不規范使用和結核分枝桿菌自身細胞壁結構等特點，導致結核分枝桿菌對抗結核藥物產生耐藥性[5]，給結核病的防治帶來了嚴峻的挑戰。

結核分枝桿菌對藥物產生耐藥性是自身生存的一種本能。其對抗結核病藥物的抗性主要是由染色體上的基因或單核苷酸多態性(SNP)突變介導的[6]。抗結核病藥物的不規范使用，提高了結核分枝桿菌對正在使用的抗結核病藥物發生耐藥性的概率。如分枝菌酸中某些基因(如rpoB或gyrA)發生突變，降低了抗結核病藥物與靶基因的結合能力，削弱藥物治療效果[7]。結核病的治療要把握黃金時期，在確診后的前2個月，服用一線藥物(異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺)，之后再服用4個月的異煙肼和利福平[8]，提高結核病治療效果的同時降低了耐藥發生的概率。由于目前多藥耐藥和耐多藥結核病的發生概率逐年增加，因此通過分析結核分枝桿菌自身組成成分及其對抗結核病藥物產生抗性的分子機制，有利于開發新的藥物靶點，提高結核病治愈率。

1 原發性耐藥(primary drug resistance)

若宿主未接受過抗結核病藥物的治療，結核分枝桿菌產生耐藥性的現象稱為原發性耐藥。da Silva等[9]發現原發性耐藥的出現與結核分枝桿菌組成結構密切相關，當結核分枝桿菌組成結構發生變化，降低其對抗菌藥物的敏感性從而引發原發性耐藥。與革蘭氏陰性菌的細胞壁相比，原發性耐藥降低了結核分枝桿菌細胞壁的滲透性，從而干擾營養物質或藥物的運輸[10]，同時低滲透性對宿主體內的分枝桿菌起到保護作用，使結核分枝桿菌逃避宿主的免疫監視[10]。

近年來隨著結核分枝桿菌結構不斷被解析，Batt等人對其結構進行了深層次的闡述(圖1)，結核分枝桿菌細胞壁主要由脂質和碳水化合物構成，其中脂質大約占40%[10]。其細胞壁分為內外兩層，內層由肽聚糖、阿拉伯半乳糖和霉菌酸共價連接在一起，形成肽聚糖-阿拉伯半乳糖-霉菌酸MA-AG-PG復合物(mAGP)，構成其滲透性屏障[11]。外層由脂質和蛋白質組成，其中脂質可與細胞壁自由結合。細胞壁中的肽聚糖是菌體所特有的，是由N-乙酰基胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺通過-1,4糖苷鍵連接成的糖聚骨架，肽聚糖網狀排列方式有利于維持菌體形態，可為菌體的生長繁殖提供足夠空間[12]。阿拉伯半乳糖由半乳糖和阿拉伯糖殘基組成，是肽聚糖與霉菌酸連接的橋梁。Birch等[13]研究發現Rv2673是M.tb的阿拉伯呋喃糖基轉移酶C，可將Araf殘基從DPA轉移到阿拉伯多糖結構域形成α(1→3)Araf殘基導致分枝桿菌AG非還原性末端Ara6基序遠端的分支阿拉伯多糖結構域。Rv2673缺失會影響結核分枝桿菌細胞壁中阿拉伯糖結構的形成。Rv2673的過表達促進脂多糖合成，降低宿主細胞對結核分枝桿菌的免疫應答能力。由M.tb的多聚磷酸激酶(PPK)和胞外多聚磷酸酶(PPX)分別參與無機多聚磷酸鹽(poly(P))的合成和水解的反應，該反應在M.tb持久性中具有重要的調節作用。多聚(P)的積累與M.tb生長受限有關。Rv1026是一種具有長鏈多聚磷酸酶水解活性的新型胞外多聚磷酸酶。Shi等[14]發現，M.tb在巨噬細胞感染期間，結核多聚(P)的累積導致生長減慢和對異煙肼的敏感性降低，對熱和酸性pH的抵抗力增強，并增強細胞內存活，同時低滲透性對宿主體內的結核分枝桿菌的生長起到保護作用，引起機體發病。細胞壁的滲透性主要由霉菌酸決定，霉菌酸主要由長鏈α-烷基-β-羥基脂肪酸構成[15]，其脂肪酸長度的增加會抑制菌體對親脂分子的吸收[16]。它以海藻糖單菌酸或海藻糖二菌酸的形式存在于菌體細胞壁，形成不對稱的外脂雙層內小葉結構[15]，此結構提高了結核分枝桿菌發生原發性耐藥的概率。

圖1 結核分枝桿菌細胞壁組成示意圖[16]Fig.1 Schematic diagram of the cell wall composition of Mycobacterium tuberculosis[16]

2 獲得性耐藥(acquired drug resistance)

當宿主的免疫防御機制無法清除入侵的結核分枝桿菌時，就會引發活動性結核病，此時會采用藥物進行抗結核病治療。但當結核分枝桿菌發生基因突變或獲得外源性耐藥基因時，就會降低結核分枝桿菌對藥物的敏感性，發生獲得性耐藥[17]，其中一線藥物獲得性耐藥機制圖改編自Khawbung的一線藥物作用方式圖(圖2)[18]，二線藥物獲得性耐藥機制改編自Hamdde的與抗結核藥物有關的蛋白質/RNA/基因圖(圖3)[19]。耐藥結核病可分為單耐藥(monoresistance-tuberculosis, MR-TB)、多耐藥(poly-drug resistant tuberculosis, PDR-TB)、耐多藥(multidrug-resistance tuberculosis, MDR-TB)

和廣泛耐藥結核病(extensive drug resistangce-tuberculosis, XDR-TB)。對利福平和異煙肼都耐藥的稱耐多藥結核病；除對一線藥物異煙肼和利福平耐藥外，還對氟喹諾酮類藥物及二線的3種注射類藥物(阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素)中至少一種耐藥的稱為廣泛耐藥結核病。基因突變是一線藥物(如乙胺丁醇)、二線藥物(如乙硫異酰胺)和新藥(如SQ-109)發生獲得性耐藥的主要原因。

2.1 一線抗結核病藥物

2.1.1 利福平 利福平是對代謝活躍或緩慢的結核分枝桿菌均有活性的藥物，它通過與RNA聚合酶β亞基的結合，抑制蛋白質的合成[20]，因此結核分枝桿菌中rpoB基因突變是結核分枝桿菌對利福平產生耐藥的重要原因。此外，Miotto[21]團隊發現利福布汀與利福平存在交叉耐藥，當Asp516Ala和Arg529Gln發生雙突變，會促進菌體對二者的耐藥[22]。Sinha[23]發現了新的耐利福平突變位點：包括528密碼子Arg-Cys突變、518密碼子Asn-Asp突變、506密碼子Phe-Leu突變、511密碼子Leu-Pro突變、513密碼子Gln-Val/Glu/Pro/Leu突變和510密碼子Gln-His突變，新的突變位點的出現是M.tb適應藥物暴露的結果。

2.1.2 異煙肼 異煙肼是在1952年引入的抗結核病關鍵藥物，是聯合治療活動性肺結核最有效的藥物之一，也是治療潛伏性肺結核的單一藥物。它由過氧化氫酶-過氧化物酶激活，最終形成異煙酰乙酸—NADH復合物[24]，可抑制結核分枝桿菌的增殖。katG是編碼過氧化氫酶—過氧化物酶的主要基因，當katG基因突變可促進分枝菌酸細胞壁的合成使菌體對異煙肼的耐藥[25]。KatG表達與INH-MIC變化呈負相關，當KatG表達減少2倍導致MIC增加略大于2倍。當結核分枝桿菌inhA基因位點發生堿基插入、缺失或突變，是結核分枝桿菌對異煙肼耐藥的另一個原因。當結核分枝桿菌對異煙肼和利福平都產生抗性，會引起耐多藥結核病。DanA與M.tbRv0010c-Rv0011c基因間區域特異性結合，二者的突變均可介導INH耐藥性。DanA突變與高水平耐藥有關，danA/Rv0010c-Rv0011c突變產生了對INH中水平耐藥[26]。M.tb的Rv2170具有N-乙酰轉移酶結構域，能乙酰化INH，是M.tb抗異煙肼的另一新機制[27]。

2.1.3 乙胺丁醇 乙胺丁醇它是一種抗菌藥物。它通過抑制阿拉伯糖基轉移酶(主要由embCAB操縱子編碼)阻斷阿拉伯半乳糖的合成，降低細胞壁通透性殺死結核分枝桿菌[28]。研究發現結核分枝桿菌中ubiA和embB基因突變會提高結核桿菌對乙胺丁醇的耐藥性，但具體機理還需加以驗證[29]。EmbR轉錄因子調控embCAB操縱子，embR的磷酸化可調控其活性，促進其與DNA結合，導致embCAB基因轉錄增加，抗性改變[30]。

2.1.4 吡嗪酰胺 吡嗪酰胺與乙胺丁醇都是治療耐多藥結核病的抗菌藥物，吡嗪酰胺由pncA編碼的吡嗪酰胺酶水解為吡嗪酸。當pncA基因發生突變，吡嗪酸會抑制菌體細胞膜的功能，干擾細菌膜與胞內胞外的物質轉運，使菌體對吡嗪酰胺產生耐藥性。研究表明除pncA外，rpsA和panD突變也會使菌體產生耐藥性[31]。rpsA突變后與吡嗪酸相互作用，促進tmRNA的傳遞，加速結核分枝桿菌“反式翻譯”(trans-translation)過程[17]。panD發生突變有助于吡嗪酸加速輔酶A與泛酸鹽的反應，促進結核分枝桿菌新陳代謝，減弱藥物抗菌作用使菌體產生耐藥性。Zhang等[32]對吡嗪酰胺進行了藥效與毒力學分析，發現吡嗪酰胺的藥效與其濃度成正比，但吡嗪酰胺必須聯合利福平同時使用才能縮短結核病的治療時間。

2.1.5 鏈霉素 鏈霉素是從灰鏈霉菌培養液中提取的。它通過與結核分枝桿菌核糖體30S亞基16S rRNA和S12核糖體蛋白作用，阻礙tRNA與30S亞基的結合，干擾蛋白質的生物合成[33],造成菌體裂解死亡。因此編碼核糖體30S亞基16S rRNA的rrs基因和編碼S12核糖體蛋白的rpsL基因突變是結核分枝桿菌對鏈霉素耐藥的主要原因。

注:利福平靶點位于RNA聚合酶β亞基；異煙肼靶點為InhA和KatG基因；乙胺丁醇靶點為Emb-B基因；吡嗪酰胺靶點為PncA,RpsA和PanD基因；鏈霉素靶點在Rrs和RpsL基因中,當藥物作用的靶點基因發生突變會引發結核分枝桿菌對一線藥物的耐藥性。圖2 一線藥物獲得性耐藥機制圖Fig.2 Diagram of the mechanism of first-line drug-acquired resistance

2.2 二線抗結核病藥物

2.2.1 阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素 當結核病患者對一線抗結核病藥物產生耐藥性，臨床上會聯合二線抗結核病藥物繼續進行治療。其中二線抗結核病注射類藥物阿米卡星和卡那霉素通過與菌體16S核糖體RNA結合，抑制菌體蛋白的合成[34]。編碼16S核糖體RNA的rrs基因突變，會削弱阿米卡星與卡那霉素對結核分枝桿菌的抑制作用。Islam團隊[35]發現，編碼氨基糖苷乙酰基轉移酶的eis基因突變，結核分枝桿菌會對阿米卡星和卡那霉素產生低水平的抗性。卷曲霉素是1979年首次用于治療結核病的多肽類抗生素，研究發現，臨床上單用卷曲霉素治療結核病極易產生耐藥性[36]，必須聯合其它抗結核病藥物(如異煙肼和乙胺丁醇)一起使用。

2.2.2 乙硫異酰胺 臨床上治療抗結核病的二線藥物除注射劑外還有乙硫異酰胺。乙硫異酰胺是一種治療結核病的前藥，其抗菌活性遠低于異煙肼。編碼黃素單加氧酶的ethA或NADH特異性烯酰基載體蛋白還原酶的inhA基因發生突變[37]，有助于細胞壁中霉菌酸的合成，降低其通透性。Mugumbate[38]團隊發現ethR基因過表達，降低ethA蛋白活性，延緩轉錄，進而減弱了乙硫異酰胺對結核分枝桿菌的抑制作用。通過溶解曲線評估inhA突變是否可作為預測乙硫異酰胺耐藥性的分子標志，因突變的inhA可能不對乙硫異酰胺產生抗性，所以一般不用inhA基因檢測該藥的耐藥性[39]。

2.2.3 氟喹諾酮類 氟喹諾酮類是治療廣泛耐藥結核病的首選藥物。研究發現，DNA促旋酶是氟喹諾酮類藥物作用的靶標，編碼DNA促旋酶的gyrA和gyrB基因發生突變，有利于菌體DNA的合成，加速結核分枝桿菌的分裂，使菌體產生耐藥性[40]。Chawla[41]團隊在印度南部某三級醫療中心進行結核分枝桿菌對氟喹諾酮耐藥基因的檢測，發現gyrA在第90、91和94位密碼子和gyrB基因G1498A的突變較為常見。

2.2.4 對氨基水楊酸 對氨基水楊酸雖屬于對氨基苯甲酸同似物，但其在治療疾病時與對氨基苯甲酸起拮抗作用，是治療結核病的抑菌劑。其通過調節葉酸的合成[42]，控制菌體代謝。當結核分枝桿菌Folc基因發生突變，會加速菌體內葉酸的合成速度，提高菌體對該藥代謝速率產生耐藥性[43]。異煙肼或乙胺丁醇等一線抗結核病藥物與對氨基水楊酸聯合使用可延緩結核分枝桿菌耐藥性的發生。Wang[42]團隊發現丙烯胺N-乙酰基轉移酶過表達，對氨基水楊酸的最小抑菌濃度將提高2倍，減弱宿主內對氨基水楊酸對分枝菌酸的抗菌作用。

2.2.5 D-環絲氨酸 D-環絲氨酸是抑制結核分枝桿菌活性弱于鏈霉素的二線抗結核病藥物，該藥是治療耐多藥與廣泛耐藥結核病的常用藥物。它可抑制菌體細胞壁肽聚糖合成關鍵酶：D-丙氨酸消旋酶和D-丙氨酸連接酶，阻止肽聚糖的生物合成，降低細胞壁滲透性[44]，促進菌體與藥物結合，消滅宿主體內的結核分枝桿菌。因細菌對其產生耐藥性的幾率較小，所以此藥常用于受結核分枝桿菌侵染人群的治療。研究表明，結核分枝桿菌alr、ald、ddlA和cycA基因發生突變會對D-環絲氨酸產生耐藥性[45]。這些基因發生突變，增加菌體細胞壁的厚度，使藥物難以滲透過細胞壁，令菌體對D-環絲氨酸產生耐藥性。

2.2.6 利奈唑胺 利奈唑胺是人工合成的惡唑烷酮類抗生素，它通過與50S核糖體亞基上肽基轉移酶中心的tRNA的結合與抑制，阻礙結核分枝桿菌生長，其在臨床上與其他抗菌藥較少發生交叉耐藥現象,且在體外也不易誘導細菌發生耐藥[46]。Bolhuis等[47]研究發現，利奈唑胺可破壞結核分枝桿菌細胞壁完整性，令其它藥物(如異煙肼)更易于通過，達到殺死結核分枝桿菌的目的。當結核分枝桿菌rrl和rplc基因發生突變時，有助于促進菌體蛋白的合成，為結核分枝桿菌的繁殖提供足夠的營養，降低利奈唑胺對結核分枝桿菌活性的抑制作用。Fermeli[48]團隊發現長期服用該藥會導致嚴重的不良反應，如血小板減少、乳酸中毒和眼部神經病變等。

2.2.7 氯法齊明 氯法齊明是治療麻風病和結核病的抗真菌藥物，Gopal[49]團隊發現當巨噬細胞中含有高濃度的氯法齊明，其會抑制結核分枝桿菌衍生因子對吞噬細胞的殺傷作用，抑制菌體生長繁殖。氯法齊明通過干擾菌體蛋白的合成，抑制結核分枝桿菌的活性。Mothiba等人通過肉湯和平板稀釋法發現，當氯法齊明的MIC為0.06 mg/L可抑制結核分枝桿菌的生長，當MIC為2.5 mg/L時可抑制恥垢分枝桿菌的生長[50]。研究發現，結核分枝桿菌Rv0678基因的非靶向突變會使外排泵發生上調，進而加快菌體生長速度，使分枝菌酸對氯法齊明發生耐藥[22]。氯法齊明可促進中央記憶T細胞免疫應答，通過阻斷Kv1.3的T細胞表面上鉀離子通道降低效應記憶T細胞群功能，縮短耐多藥結核病的治療時間[51]。

2.3 新 藥

2.3.1 貝達喹啉 貝達喹啉多用于耐多藥結核病的治療，其可消滅宿主體內潛伏的結核分枝桿菌。它通過與ATP合酶的α和c亞基緊密結合(由atpE基因編碼)調節結核分枝桿菌活性，當atpE基因發生突變，削弱了貝達喹啉抑菌或殺菌作用，令結核分枝桿菌對該藥產生抗性。因貝達喹啉消除半衰期需5～6個月，明顯長于其他抗結核病藥物，所以在臨床用藥時應考慮其藥代動力學特征[52]。Ismail等[53]發現結核分枝桿菌中編碼MmpR5阻遏蛋白的Rv0678發生突變，將會促進MmpL5-MmpS5外排泵的過表達，減弱藥物與靶點的結合能力。Ismail[54]在另一項研究中發現atpE突變出現的頻率與Rv0678突變頻率成正比，且在低MIC條件下有利于Rv0678基因發生突變，反之則利于atpE基因發生突變。

注：阿米卡星和卡那霉素都作用于Rrs和Eis基因；卷曲霉素作用于RpsL基因；乙硫異酰胺作用于EthA和InhA基因；氟喹諾酮類藥物作用于gyrA和gyrB基因；對氨基水楊酸作用于FolC基因；D-環絲氨酸作用于alr，DdlA和CycA基因；利奈唑胺作用于RrL和RplC基因；氯法齊明作用于Rv0678，調控細胞壁滲透性，當藥物作用的靶點基因發生突變會引發結核分枝桿菌對二線藥物的耐藥性。圖3 二線藥物獲得性耐藥機制圖Fig.3 Diagram of acquired resistance mechanism of second-line drugs

2.3.2 德拉馬尼和Pretomanid 德拉馬尼與Pretomanid都是治療結核病的新藥，它們的出現給結核病患者帶來新的福音。德拉馬尼是一種新型分枝桿菌細胞壁合成抑制劑，它通過阻礙細胞壁霉菌酸的合成，提高細胞壁的滲透性，達到殺死結核分枝桿菌的目的[55]，反之當結核分枝桿菌中ddn、fgd1和fbiA/B/C基因發生突變則會令菌體對德拉馬尼產生耐藥性。Mallikaarjun[56]發現當德拉馬尼與利福平和乙胺丁醇同時用于結核病患者治療時，宿主會減少對德拉馬尼的吸收。Liu[57]的團隊根據臨床數據推測因德拉馬尼有良好的耐受性，所以可能不易產生致癌性。Pretomanid屬于硝基咪唑類抗生素，是抗結核病的前藥，它對潛在或耐多藥結核分枝桿菌均有抑菌效果。當結核分枝桿菌進行繁殖時，Pretomanid抑制細胞壁霉菌酸的合成，進而抑制結核分枝桿菌的增殖，在非復制條件下，Pretomanid被脫氮黃素依賴的硝基還原酶降解，產生具有較強抗真菌活性的氮，阻止結核分枝桿菌的繁殖[58]。研究發現當結核分枝桿菌中Rv3547和Rv0407基因發生突變時，破壞細胞壁的完整性，降低Pretomanid抑菌作用，令結核分枝桿菌對Pretomanid產生抗性[22]。

2.3.3 SQ-109 SQ-109對廣泛耐藥結核病有較好的治療效果，是一種不對稱二胺，其對結核分枝桿菌的抑制作用與MmpL3基因密切相關[59]。MmpL3是將霉菌酸運輸到結核分枝桿菌外膜所必須的基因，當MmpL3基因發生突變，將加速霉菌酸的合成，降低細胞壁通透性，減弱SQ-109對結核分枝桿菌的殺傷作用，令菌體產生耐藥性[60]。當SQ-109與利福平、貝達喹啉和異煙肼共同使用時，SQ-109與利福平的協同作用更顯著。Jia采用SQ-109、異煙肼與乙胺丁醇共同治療已被結核分枝桿菌侵染的小鼠，檢測SQ-109的抗菌活性，得出結論：SQ-109抑菌活性與異煙肼相似，且更優于乙胺丁醇[61]。

3 展 望

由于抗結核病藥物的不規范使用，結核分枝桿菌的不斷進化，使其可以逃避宿主的免疫監控，降低了抗結核病藥物對結核分枝桿菌的抑制作用。研究結核分枝桿菌的耐藥機制，尋找新的藥物靶點，開發最新型抗結核病藥物已迫在眉睫。通過分析結核分枝桿菌發生耐藥性的原因，其一可避免在治療結核病時使用已發生耐藥性的藥物，提高結核病治愈的幾率；其二有助于發現新型藥物靶點，促進對新型抗結核病藥物研發。新型抗結核病藥物的研發將大大提高結核病患者的康復率，所以我們必須重視結核分枝桿菌的耐藥機制。

利益沖突：無

引用本文格式：鄭偉，田甜，王琦，等.結核分枝桿菌的耐藥機制研究進展[J].中國人獸共患病學報，2021，37(11)：1044-1052. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.148