山東省濰坊市農村人群海氏腸球菌惡唑烷酮類耐藥基因流行情況研究

王曉慧，王 爽，張 倍，胡 軍

腸球菌是一種革蘭氏陽性球菌，能夠引起泌尿道、血流等多種臨床感染[1-2]，約占醫院感染或醫院獲得性感染的10%，是全世界敗血癥的主要原因[3]。海氏腸球菌在臨床上的感染發生率較低[4]，但病例都為與菌血癥相關的嚴重疾病，且感染病例正在增加[5]。耐藥基因cfr、optrA、poxtA均可介導惡唑烷酮類(利奈唑胺)和苯丙醇類(氟苯尼考)耐藥。3種耐藥基因均在多個地區不同來源的革蘭氏陽性球菌(主要在葡萄球菌和腸球菌)中被檢出，近年陽性率有所上升，且存在人獸傳播的風險[6-9]。畜牧業抗生素的殘留能夠將細菌的抗藥性轉移給人類[10]。健康人群中攜帶的耐藥基因也可能造成人與人、人向環境或食物的傳播[11]。本研究通過對來自山東省濰坊市的12個村的620份糞便樣品進行檢測，研究農村地區健康人群中海氏腸球菌的耐藥性和耐藥基因cfr、optrA、poxtA的攜帶率，有助于了解農村人群中惡唑烷酮類耐藥基因的流行情況及存在的公共衛生隱患。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 2017年在山東省濰坊市12個村對全體無癥狀健康常住村民進行采樣，采樣對象最小年齡6歲，最大年齡94歲；其中男性360人，女性260人。共收集到620份無重復糞便樣本，低溫運送至實驗室，于-80 ℃條件保存。

1.2 主要儀器與試劑 基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF-MS) 購自德國Brukert公司； PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；毛細管凝膠電泳儀購自德國QIAGEN公司；脈沖場凝膠電泳儀、凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司。腸球菌培養基 (疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂) 基礎、Mueller-Hinton瓊脂 (MHA) 購自北京陸橋技術股份有限公司；氟苯尼考、萬古霉素、四環素、環丙沙星、利奈唑胺、氯霉素、慶大霉素、利福平、呋喃妥因、美羅培南、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑、阿莫西林，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司；克拉維酸購自于中國食品藥品檢定研究院；細菌DNA提取試劑盒產自北京天根生化科技有限公司；PCR反應體系、SmaⅠ限制性酶切體系均購自日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 細菌分離與鑒定 糞便樣本接種劃線于氟苯尼考 (10 mg/L) 腸球菌選擇性培養基，37 ℃培養過夜，篩選出腸球菌。用無菌取菌環挑取單個菌落接種于哥倫比亞血平板上，37 ℃培養過夜，分離純化細菌后，MALDI-TOP-MS鑒定細菌種屬。

1.4 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法進行藥敏試驗，糞腸球菌ATCC 29212作為質控菌株。測定共14大類15種抗菌藥物的最小抑菌濃度 (minimum inhibitory concentration, MIC)，包括：四環素、萬古霉素、氨芐青霉素、環丙沙星、氯霉素、利奈唑胺、利福平、呋喃妥因、硫酸慶大霉素、美羅培南、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、復方新諾明、阿莫西林/克拉維酸。結果判定參照美國臨床和實驗室標準協會推薦方法 (CLSI 2019) 和歐盟藥敏試驗標準委員會推薦方法 (EUCAST 2019)。

1.5 耐藥基因cfr、optrA、poxtA的檢測 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取海氏腸球菌DNA。以DNA為模板，使用PCR擴增cfr、optrA、poxtA基因，毛細管凝膠電泳檢測目的條帶。具體引物序列和PCR反應條件如表1所示。

表1 耐藥基因cfr、optrA、poxtA引物序列信息Tab.1 Primer sequences for resistance genes cfr, optrA, poxtA

1.6 脈沖場凝膠電泳 使用PFGE對poxtA陽性菌株進行分子分型分析。使用限制性內切酶SmaⅠ酶切體系對海氏腸球菌全基因組進行酶切，沙門菌H9812經過XbaⅠ限制性內切酶切后作為分子量參考標準。凝膠成像系統獲得PFGE指紋圖譜，BioNumerics (Version 6.0) 軟件進行聚類分析。

2 結 果

2.1 菌株分離與藥敏試驗結果 12個村620份糞便樣本共分離獲得29株海氏腸球菌，分離率為4.68%。29株海氏腸球菌對克林霉素和四環素全部耐藥，對氯霉素、復方新諾明、紅霉素、利福平、環丙沙星、呋喃妥因、慶大霉素、美羅培南、左氧氟沙星的耐藥率分別是96.6% (28/29)、75.9% (22/29)、58.6% (17/29)、37.9% (11/29)、17.2% (5/29)、13.8% (4/29)、10.3% (3/29)、3.4% (1/29)、3.4% (1/29)，對氨芐青霉素和阿莫西林/克拉維酸均敏感。除兩株萬古霉素中介菌株外，未檢測到萬古霉素耐藥菌株。利奈唑胺耐藥率為10.3% (3/29)，在剩余的海氏腸球菌中，有4株利奈唑胺MIC值被判定為中介 (MIC=4 mg/L)，其余22株被判定為對利奈唑胺敏感。多重耐藥菌株檢出率為100%。所有海氏腸球菌耐藥表型見表2。

表2 29株海氏腸球菌耐藥性及耐藥基因的攜帶情況Tab.2 Antibiotic resistance and resistance genes of twenty-nine Enterococcus hiraes

AM：氨芐青霉素；VAN：萬古霉素；TE：四環素；CIP：環丙沙星；LNZ：利奈唑胺； CL：氯霉素；GM：慶大霉素；RA：利福平；FD：呋喃妥因；MEM：美羅培南；LVX：左氧氟沙星；ERY：紅霉素；CC：克林霉素；SXT：復方新諾明；AMC：阿莫西林/克拉維酸。

2.2 耐藥基因cfr、optrA、poxtA檢出結果 29株海氏腸球菌中有28株攜帶cfr、optrA和poxtA中的一種或兩種耐藥基因，有一株未檢測到以上任何耐藥基因。未檢測到攜帶cfr基因的菌株；optrA陽性菌株有25株，陽性率為86.2% (25/29)；poxtA基因陽性菌株有5株，陽性率為17.2% (5/29)；同時攜帶optrA和poxtA基因的有2株。具體信息見表2。

2.3 PFGE分型結果 5株poxtA陽性海氏腸球菌被分為5種PFGE帶型，呈現高度多態性。結果如圖1所示：H1和H2屬于一個分支，帶型相似度為85.7%；H3和H4屬于一個分支，帶型相似度為88.2%；上述兩個分支間的相似度為81.1%；H5與H1、H2、H3、H4不在一個分支，相似度為76.8%。

圖1 5株poxtA陽性海氏腸球菌PFGE聚類圖Fig.1 PFGE cluster of five poxtA-positive Enterococcus hiraes

3 討 論

腸球菌不僅是醫院感染的常見細菌，也是獲取、保存、傳播各種耐藥基因的中心樞紐[12]。海氏腸球菌作為腸球菌的一個種屬，近年來由它引起的人類感染時有發生。例如，西班牙報道的菌血癥肺炎[1]，韓國、土耳其報道的尿路感染[13-14]，美國、丹麥報道的心內膜炎[15-16]，此外，美國還報道了一例嬰兒血流感染病例[5]。在既往耐藥基因cfr、optrA、poxtA的研究中，絕大部分集中在糞腸球菌和屎腸球菌，海氏腸球菌研究結果較少。研究表明，在動物源海氏腸球菌存在攜帶多種耐藥的可移動遺傳元件，有助于包括poxtA在內的耐藥基因在腸球菌中的傳播和持續存在[17]。

本研究從620份農村健康人糞便樣本中分離出29株海氏腸球菌,檢出率4.68%，相比動物源海氏腸球菌檢出率低，目前，尚未有人源海氏腸球菌的報道[17-18]。藥敏試驗結果顯示，海氏腸球菌耐藥情況嚴重，利奈唑胺耐藥率為10.3% (3/29)，藥敏結果提示利奈唑胺低水平耐藥。cfr未在本研究中檢出，但optrA和poxtA陽性率高。Hua等[19]報道了optrA基因在利奈唑胺低水平耐藥機制中有重要作用。提示海氏腸球菌中，optrA也可能與利奈唑胺低水平耐藥有關，但需研究證明。PFGE分析顯示海氏腸球菌屬于不同的帶型，表明山東省濰坊市農村健康人群糞便攜帶的poxtA陽性海氏腸球菌基因型表現為高度的多態性，這可能受海氏腸球菌例數較少的影響。本研究中海氏腸球菌利奈唑胺耐藥率低于Cai等[11]的健康人群糞腸球菌和屎腸球菌利奈唑胺的耐藥率，而optrA陽性率則高于Cai等[11]的研究，這可能與采樣地區和腸球菌種屬相關。

綜上所述，本研究中海氏腸球菌耐藥情況嚴重，耐藥基因攜帶率高，poxtA陽性菌親緣關系較遠。農村地區常住人口組成特殊，農場和屠宰場分布較多，由于知識水平限制，容易不規范使用甚至濫用抗生素，使細菌產生耐藥性。為防止耐藥菌在農村健康人群中的傳播，應宣傳規范用藥，加強對環境和食品中抗生素和耐藥菌的監測。此外，既往研究表明，醫院病人中利奈唑胺耐藥率和三種惡唑烷酮耐藥基因陽性率較高[20]，因此醫療機構也應做好相關預防措施，避免通過醫療過程造成不同人群間耐藥菌的傳播。

利益沖突：無

引用本文格式：王曉慧，王爽，張倍，等.山東省濰坊市農村人群海氏腸球菌惡唑烷酮類耐藥基因流行情況研究[J].中國人獸共患病學報，2021，37(11)：1017-1021. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.142