貴州省雞源彎曲菌的流行現狀及抗生素敏感譜研究

李 軒，謝 春，周 藜，汪淑穎，周 倩，張德著，向 紅,

彎曲菌(Campylobacter)作為一種食源性人獸共患病原菌，感染該菌后除了引起腹瀉等腸道疾病外，還可能引起菌血癥、反應性關節炎及格林-巴利綜合征等嚴重并發癥。歐盟最新報告顯示彎曲菌病是最常見的人獸共患病，該疾病的83.9%與空腸彎曲菌有關，10.3%與結腸彎曲菌有關[1-2]。在中低收入國家中，彎曲菌是通過動物糞便傳播的重要病原菌[3]。家禽(尤其是雞)是彎曲菌天然宿主，該菌可作為一種共生菌存活在禽類腸道中并持續向外排菌。通過多位點序列分型技術發現全球數據庫中引起彎曲菌病的主要克隆復合體與從雞分離的主要克隆復合體相似[4]，在禽類養殖等關鍵環節采取生物安全措施是降低人類彎曲菌病流行率的最有效策略。貴州省是“全域養雞、全民吃雞”的少數省份之一，其禽類養殖業是養殖業中覆蓋面最廣、商品化程度最高的產業[5]。有必要了解貴州省雞源彎曲菌的流行現狀，預測疾病發生風險。

雖然感染彎曲菌的禽類不需要抗生素治療，但在預防控制其它疾病的過程中，大量抗生素的使用將產生彎曲菌耐藥株。2013年美國疾病控制和預防中心發布的一份報告中表示耐藥性彎曲菌被列為“威脅級別嚴重的微生物”，在對中低收入國家動物源菌株抗生素耐藥性(AMR)研究中發現耐藥水平最高的是印度和中國[6]，形勢不容樂觀。2020年北京首次報道了一起由多重耐藥結腸彎曲菌引起的嚴重胃腸炎暴發[7]。因不同地區在肉雞養殖過程中抗生素的選擇和用量標準不同，耐藥情況存在差異，目前關于貴州省雞源彎曲菌的耐藥現狀鮮有報道。

國內外部分地區對雞源彎曲菌的流行現狀做過調查，但貴州省雞源彎曲菌的流行狀況尚未見詳細報道。本研究以農貿市場和養殖場肉雞為研究對象，調查彎曲菌攜帶情況，評估雞源彎曲菌耐藥表型和多重耐藥的流行趨勢，分析分離株耐藥表型與耐藥基因的相關性及交叉耐藥情況，以期為指導貴州省肉雞養殖業抗菌藥物的合理使用以及為臨床合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 將貴州省按東、西、南、北、中劃分為5個片區進行隨機抽樣，在養殖場和農貿市場共采集359份新鮮糞便樣本，將棉拭子蘸取糞便后插入Cary-Blair運送培養基中，4 ℃條件下送實驗室檢測。

1.2 主要儀器與試劑 全自動快速生物質譜檢測系統(microflex LT/SH MALDI-MS System)購自布魯克(北京)科技有限公司；Cary-Blair運送培養基購自青島海博生物技術有限公司；Bolton肉湯、哥倫比亞血平板購自廣東環凱微生物科技有限公司；彎曲菌培養檢測試劑盒(雙孔濾膜法)、彎曲菌生化檢測試劑盒、彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒購自青島中創匯科生物科技有限公司；Premix Taq(Takara Taq Version 2.0 plus dye)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 分離培養 采用雙孔板濾膜法分離彎曲菌，挑取適量糞便樣本放入促生長增菌液中增菌24 h后，取150 μL滴加于雙孔板濾膜上，42 ℃微需氧條件下(5%O2、10%CO2、85%N2)培養48 h，將鏡檢形態為G-、S形或螺旋形等可疑菌落純化后進行生化鑒定。

1.4 菌種鑒定 參照國標GB4789.9-2014進行生化鑒定，將生化鑒定為彎曲菌屬的菌株通過MALDI-TOF MS進一步鑒定，即用無菌接種環挑取單個菌落均勻涂于靶板上，待菌落干燥后，滴加1 μL CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質液完全覆蓋菌落，在室溫下自然干燥后進行檢測，每株細菌從點靶到上機重復2次試驗。

1.5 藥敏試驗 參照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法(Agar Dilution Method)對菌株進行藥敏試驗，使用彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒進行試驗，其中抗菌藥物包含7類11種。42 ℃微需氧培養24 h后讀取結果，空腸彎曲菌ATCC33560、結腸彎曲菌ATCC43478作為質控菌株。對紅霉素、環丙沙星、四環素的敏感性判定依據CLSI M45-3rd版，對其余抗生素的敏感性判定依據美國NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)和歐盟EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)的推薦標準。

1.6 耐藥基因檢測 參照文獻[8-10]，ermB、cmeA、cmeB、cmeC、RE-cmeABC、aadE3-sat4-aphA-3、cfr、Tet(O)、blaOXA-61耐藥基因的引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR反應體系為：2×Premix Taq12.5 μL，10 pmoL/mL上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，無菌ddH2O補足至25 μL。反應體系：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，54.5～56.5 ℃(不同基因退火溫度不同)退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環，最后72 ℃延伸5 min。取1 μL擴增產物加樣于1.0%瓊脂糖凝膠中，120 V電壓下電泳20 min，通過凝膠成像系統成像。

1.7 統計學分析 運用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。不同抗菌藥物間的耐藥相關矩陣使用GraphPad Prism 8.0軟件繪制(|r|<0.4為弱相關，0.4≤|r|≤0.7為中等相關，|r|>0.7為強相關。

2 結 果

2.1 流行病學分析 359份糞便樣本共檢出156株(43.5%)彎曲菌，包括68株(43.6%)空腸彎曲菌和88株(56.4%)結腸彎曲菌；春冬和夏秋季節彎曲菌檢出率分別為43.1%和44.0%，兩者之間差異無統計學意義(χ2=0.033，P>0.05)；在不同地理區域上，東、西、南、北、中部地區檢出率分別是32.3%、48.0%、50.5%、45.2%、54.3%；工業化養殖和自由散養雞群中彎曲菌檢出率分別為28.1%和45.5%，差異有統計學意義(χ2=7.014，P<0.05)；養殖規模小于10 000只雞的彎曲菌檢出率高于規模大于10 000只的養殖場(χ2=21.137，P<0.05)；養殖場與居民生活區距離小于2.5 km的雞源彎曲菌檢出率高于距離大于2.5 km的檢出率(χ2=25.096，P<0.05)(見表1)。

表1 雞源彎曲菌的檢出情況Tab.1 Detection status of Campylobacter from chicken

2.2 耐藥分析 對其中的84株彎曲菌進行藥敏實驗，發現分離株對11種常見抗生素表現出不同程度的耐藥，耐藥率介于2.3%～90.4%(表2)。空腸彎曲菌對萘啶酸(83.3%)和四環素(83.3%)的耐藥率最高，其次為環丙沙星(66.6%)、阿奇霉素(16.6%)、鏈霉素(16.6%)和克林霉素(16.6%)；結腸彎曲菌對萘啶酸(93.3%)、四環素(90.0%)、環丙沙星(86.6%)的耐藥率較高，對氯霉素(6.6%)、氟苯尼考(1.6%)的抗性較弱；結腸彎曲菌分離株對紅霉素、阿奇霉素、慶大霉素、鏈霉素和泰利霉素的耐藥率顯著高于空腸彎曲菌；不同地域(東、南、西、北、中)、養殖方式(工業化和自由放養)、不同養殖規模彎曲菌分離株耐藥率位于前3位的抗生素均為均為萘啶酸、四環素和環丙沙星，其耐藥率分別介于82.3%～100%、82.3%～92.2%和79.4%～94.4%。

表2 84株彎曲菌對11種抗生素的耐藥情況Tab.2 Drug resistance rate of 84 Campylobacter isolates eleven antimicrobial agents

84株彎曲菌分離株對11種抗生素共產生了38種耐藥譜，空腸彎曲菌產生了13種耐藥譜，結腸彎曲菌產生了25種耐藥譜，空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的優勢耐藥圖譜都為NAL-CIP-TET。ERY-AZI-NAL-CIP-GEN-STR-CHL-TET-TEL-CLI、NAL-CIP-TET、NAL-CIP、NAL-TET是空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的共有譜型。81.0%的菌株表現出多重耐藥，其中3株菌對10種抗生素耐藥。對3種、9種抗生素耐藥的菌株較多，分別占31%和8.3%。空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的多重耐藥率分別為54.2%、91.7%，差異存在統計學意義(χ2=13.297，P<0.05)，結腸彎曲菌與空腸彎曲菌多重耐藥情況相比較嚴重(表3)。

表3 84株彎曲菌耐藥類型構成Tab.3 Major antimicrobial resistance patterns of 84 Campylobacter

2.3 耐藥基因 通過PCR檢測84株彎曲菌分離株的耐藥基因(見圖1)，結果顯示，cmeA、Tet(O)、cmeC、cmeB、blaOXA-61、cfr、ermB、aadE-sat4-aphA-3、RE-cmeABC基因檢出率由高到低依次為98.8%、98.8%、96.4%、92.8%、76.1%、36.9%、28.5%、20.2%、16.6%。其中耐藥基因cmeB(P<0.05)、blaOXA-61(χ2=12.705，P<0.05)、cfr(χ2=8.594，P<0.05)、ermB(χ2=6.743，P<0.05)在空腸彎曲菌和結腸彎曲菌中的檢出率差異存在統計學意義。同時發現耐藥基因cmeB(χ2=6.131，P<0.05)、ermB(P<0.05)、cfr(χ2=18.525，P<0.05)、blaOXA-61(χ2=10.070，P<0.05)在夏秋和春冬季節的檢出率差異存在統計學意義；cmeB(P<0.05)基因在工業化養殖和自由散養中的檢出率差異存在統計學意義；無耐藥基因在不同規模、與居民生活區距離不同的養殖場間檢出率差異存在統計學意義。

M：核酸分子量標準DL2000；泳道N：陰性對照；泳道1-9：彎曲菌分離株ermB、cfr、Tet(O)、blaOXA-61、cmeA、cmeB、cmeC、RE-cmeABC、aadE-sat4-aphA-3基因的PCR擴增結果圖1 彎曲菌分離株耐藥基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of antibiotic resistance gene in Campylobacter isolates

2.4 耐藥型和耐藥基因的相關性 通過對耐藥基因攜帶與耐藥表型相關性分析可知，紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素、克林霉素、慶大霉素和鏈霉素耐藥株中相關耐藥基因檢出率高于敏感株；而萘啶酸、環丙沙星、鏈霉素、氯霉素、氟苯尼考和四環素耐藥株和敏感株之間相關耐藥基因的檢出率差異無統計學意義，耐藥基因的攜帶與耐藥表型無關(表4)。

表4 比較耐藥菌株中攜帶耐藥基因的情況Tab.4 Comparison of resistance between the strains carrying and not carrying resistance genes

2.5 交叉耐藥情況 應用熱圖表示不同抗生素藥物的耐藥相關性(見圖2)。大環內酯類抗生素耐藥菌株共61株，其中紅霉素耐藥26株，阿奇霉素耐藥35株，交叉耐藥率為74.29%，紅霉素耐藥與阿奇霉素耐藥有關聯性(χ2=52.72，P<0.05)，r=0.79>0.7，呈高度相關；52株菌對氨基糖苷類抗生素耐藥，“-”meansFisher’sexacttest。

圖2 不同抗生素耐藥相關性熱圖Fig.2 Heat map of resistance to different antibiotics

其中22株對慶大霉素耐藥，30株對鏈霉素耐藥，交叉耐藥率為30.77%，慶大霉素耐藥與鏈霉素耐藥有關聯性(χ2=17.79，P<0.05)，r=0.46>0.4，呈中度相關；氟喹諾酮類抗生素中萘啶酸與環丙沙星間呈弱相關(r=0.36)，氯霉素類抗生素中氯霉素與氟苯尼考間呈弱相關(r=-0.04)。

3 討 論

病原性彎曲菌是世界范圍內引起人類胃腸炎的主要原因，家禽特別是肉雞及其肉制品被認為是彎曲菌感染的重要來源。從肉雞養殖、運輸、屠宰、加工、儲存、烹飪到餐桌的整個鏈條中，養殖過程中感染彎曲菌的雞是傳播病原菌、引起人類感染彎曲菌的重要源頭，有必要了解養殖場中雞源彎曲菌的流行情況。本研究中彎曲菌檢出率達43.5%，低于西班牙(62%)、非洲布基納法索(67.96%)的檢出率[11-12]，高于廣西(2.86%)、河南(23.7%)的檢出率[13-14]，說明雞源彎曲菌的地域流行特征明顯。空腸彎曲菌和結腸彎曲菌檢出率分別為18.9%和24.5%，與姚紅等[14]及中國東南部[15]的空腸彎曲菌檢出率高于結腸彎曲菌檢出率的結果不同；但與摩洛哥北部的研究結果近似[16]，且Wang等[17]分析2008—2014年間中國5個省份的雞源彎曲菌分離株的流行特征，發現優勢菌屬由空腸彎曲菌向結腸彎曲菌轉變，認為在抗生素選擇壓力下，結腸彎曲菌多重耐藥率高于空腸彎曲菌，具有更強的適應性和更高的存活率，解釋了結腸彎曲菌是優勢菌屬的原因。這與本次研究中貴州地區結腸彎曲菌檢出率較高、多重耐藥較嚴重的結果一致。

季節可能對雞群內彎曲菌流行起直接或間接作用，顏衛等發現全年中雞源彎曲菌攜帶高峰期是夏季(21.98%)[18]，西班牙的相關研究發現秋季(31.3%)雞群彎曲菌攜帶率高于春季(20.3%)[19]，而本研究中春冬季和夏秋季間雞源彎曲菌檢出率差異無統計學意義，可能與貴州省平均氣溫低，且各季節氣溫變化不明顯有關。

近年來，消費者對環境友好型產品的偏好增加了對自由散養禽類肉制品的需求。目前，肉雞的養殖模式由工業化養殖向自由散養轉變，普遍認為由于自由散養的雞群與潛在污染環境密切接觸，更易感染病原菌。在英國，自由散養的雞群中95%～100%攜帶彎曲菌，工業化養殖的雞群中55%攜帶彎曲菌[20]；在南非，小型散養、商業散養、工業化養殖雞群中彎曲菌的攜帶率分別為68%、47%、47%[21]；在馬來西亞，散養和封閉式飼養的雞群中彎曲菌攜帶率分別為46.7%～86.7%和0%～6.7%[22]。本研究得出類似結果，自由散養雞源彎曲菌的檢出率顯著高于工業化養殖的檢出率，主要由于雞有食糞的特性，從受感染的雞中攝取排泄糞便是雞群感染傳播的主要途徑，同時環境中嚙齒類動物、蒼蠅、其它昆蟲等媒介生物對病原菌傳播有一定的影響。此外，本研究發現養殖規模大小對彎曲菌感染有一定影響，養殖規模大的衛生管理措施相對完善，感染率較低。

Kaakoush等雖在種雞群中發現了很高的彎曲菌檢出率，但雞蛋中彎曲菌的檢出率極低[23]，Agunos等[24]進一步從被檢母雞及子代中分離出的彎曲菌未發現遺傳上的親緣關系。而水平傳播是彎曲菌在雞群中定殖的重要途徑[25]，Schets等[26]在肉雞、養殖場廢水和地表水中檢測到相同的STs，表明環境因素在彎曲菌傳播過程中發揮關鍵作用。本研究中發現養殖場與居民生活區距離小于2.5km的養殖場中肉雞彎曲菌攜帶率高于2.5km以外養殖場中肉雞，可能由于離居民生活區較近的養殖場容易受到人類活動、牲畜(牛、羊、豬、狗)以及蒼蠅等媒介生物的影響，其具體原因將進一步探討。

在對全球中低收入國家動物源彎曲菌AMR的研究中發現，耐藥率最高的是四環素(60%)和喹諾酮類(60%)，紅霉素的耐藥率雖低于30%但高于高收入國家[6]。彎曲菌種類方面，本研究中空腸彎曲菌和結腸彎曲菌耐藥水平位于前3均為萘啶酸、四環素和環丙沙星，且萘啶酸和四環素的耐藥率高達80%以上，耐藥情況更為嚴重，與付燕燕等[27]研究結果一致。同時，本研究發現來自不同地理區域、養殖方式和規模大小的彎曲菌耐藥水平位于前三的均為萘啶酸、四環素和環丙沙星，說明貴州省禽類養殖環節藥物使用或抗生素污染在地域上差異不明顯。

目前治療彎曲菌感染引起腸胃疾病的首選藥物是大環內酯類或氟喹諾酮類，對此類藥物的高耐藥水平將不利于臨床治療彎曲菌病。本研究中結腸彎曲菌對抗生素的耐藥率高于空腸彎曲菌，與伊朗的一項系統評價結果相反，但與國內外大部分研究結果相似，原因可能是不同國家、地區治療動物疾病或在飼料中添加的抗生素的種類和用量標準不同[15, 28-29]。2020年北京報道的一起嚴重腸胃炎暴發中所有結腸彎曲菌分離株均對萘啶酸、環丙沙星和四環素具有抗性，可見結腸彎曲菌耐藥性需要引起高度重視[7]。2018版《中國抗菌藥物管理和細菌耐藥現狀報告》顯示住院患者抗菌藥物使用率以貴州省最高(46.5%)，抗生素的廣泛使用和嚴峻的耐藥現狀將不利于臨床上彎曲菌病的治療。

本研究中81.0%的分離株呈多重耐藥，與溫州、江蘇、中國東南部研究情況相比，多重耐藥現象更為普遍[15,29-30]，且發現紅霉素與阿奇霉素、慶大霉素與鏈霉素呈中度以上的交叉耐藥，提示當彎曲菌對兩者間其中一種抗生素耐藥時，應避免使用另一種抗菌藥物。關于彎曲菌的耐藥機制目前仍在探索，本研究發現紅霉素、阿奇霉素、泰利霉素、克林霉素耐藥表型與耐藥基因存在呈正相關，但萘啶酸、環丙沙星、鏈霉素、氯霉素、氟苯尼考、四環素、慶大霉素抗生素耐藥表型與耐藥基因無相關性。該結果可能與耐藥基因位于質粒等其它移動元件上并未檢出或耐藥基因未表達等原因有關。為減少耐藥菌株的產生，應提倡有指征地合理用藥，實施抗生素輪換策略。同時，有必要研發非抗生素類抗感染藥物，以擴大藥物種類；探索控制耐藥質粒在細菌間轉移的手段，開發外排泵抑制劑；將抗生素與其他技術(例如納米技術)結合，改善抗生素靶向性，同時避免環境中亞抑菌濃度的抗生素大量殘留，以減少抗生素耐藥性的產生。

本研究初步了解了貴州省雞源彎曲菌的污染狀況，明確了耐藥表型及耐藥基因流行情況，為抗生素在禽類養殖中的規范使用以及彎曲菌病的臨床治療提供參考依據，為進一步探究耐藥機制提供實驗室數據。今后的研究中，應將“OneHealth”理念貫徹在預防控制彎曲菌感染整個環節中，綜合考慮人、動物、環境、病原等影響因素，多維度應對病原彎曲菌危害的公共衛生問題以促進人、動物、環境共同健康。

利益沖突：無

引用本文格式：李軒，謝春，周藜，等.貴州省雞源彎曲菌的流行現狀及抗生素敏感譜研究[J].中國人獸共患病學報，2021，37(11)：995-1002，1007. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.139