深圳市輸入性寨卡病毒分離株的進化分析及生物學特性研究

陽 帆，黃亞蘭，黃穗濱，熊玲紅，張曉敏，李 玥，張仁利

寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)引起，主要經媒介伊蚊叮咬傳播的一種急性傳染病, 也可通過血液傳播、性傳播和母嬰垂直傳播的方式感染人類[1-3]。寨卡病毒為黃病毒科黃病毒屬的正鏈RNA病毒，基因組由內部單一的開放讀碼框(open reading frame， ORF)和兩側的非編碼區構成，主要分為非洲型和亞洲型兩種基因型。大多數寨卡病毒感染者表現為無癥狀或輕癥感染，臨床表現主要為發熱、皮疹、關節肌肉痛和結膜炎等，但也有證據表明ZIKV感染可引起神經系統并發癥如格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)、新生兒小頭癥(Microcephaly)等先天性出生缺陷綜合癥等[4-5]。自2015年寨卡疫情在巴西暴發以來，迅速在南美、中北美蔓延，截至2018年底，已擴散到全球86個國家和地區, 感染人數超過百萬[6]。我國在2016年2月確診了首例輸入性寨卡病毒感染病例，此后廣東、浙江、北京等地先后報告輸入性寨卡病例共計20余例[7-8]。寨卡病毒全球廣泛傳播及其引起新生兒嚴重的先天異常使其由國際關注的突發公共衛生事件轉變為長期公共衛生挑戰。目前全球尚無安全有效防治寨卡病毒感染的疫苗和特異性抗ZIKV藥物。

2019年12月，一名從柬埔寨回國的旅客在深圳機場口岸入關時有發熱癥狀, 經過深圳市疾病預防控制中心確診為寨卡病毒感染，現將實驗室檢測結果報道如下。此外，本研究利用細胞培養傳代，成功從病人唾液和尿液標本中分離到了寨卡病毒。為進一步認識輸入我國的寨卡病毒, 本文還從病毒基因組序列和遺傳進化以及病毒對細胞的感染特性入手, 分析病毒的基因和生物學特性, 為我國寨卡疫情的防控提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 病例發現與標本采集 莫某某，男，33歲，中國籍，職業為建筑工人，于2019年6月18日赴柬埔寨務工，12月8日乘機回國，經深圳機場口岸入境被發現有發熱表現(體溫37.9 ℃)，無其他癥狀或體征，否認病人接觸史和蚊蟲叮咬史，無同行人員。同時采集患者咽拭子和血液標本，對其進行流感病毒通用型和登革、基孔、寨卡病毒檢測，結果為流感病毒A+B陰性；9日傍晚，深圳海關實驗室兩次血液標本檢測結果均為寨卡病毒核酸陽性。隨即送往深圳市第三人民醫院進行對癥治療和隔離，重新采樣后送至深圳市疾病預防控制中心進行復核。按照《寨卡病毒病防控方案(第二版)》[9]的要求，患者住院后連續采集血液、唾液和尿液標本，直至病毒核酸檢測結果為陰性。

1.2 主要試劑和儀器 BHK-21細胞(金黃色地鼠腎細胞)和Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)由本實驗室保存，復蘇后用含10%胎牛血清的DMEM培養液(Gibco公司)，于37℃、5%的二氧化碳條件下常規傳代培養。病毒RNA核酸提取試劑盒(High Pure Viral RNA Kit)購自Roche公司，一步法RT-PCR擴增試劑盒(PrimeScript One Step RT-PCR Kit)購自TAKARA公司。商品化寨卡病毒核酸檢測試劑盒(熒光RT-PCR法)購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，7500 熒光定量PCR儀和9700 PCR儀為美國ABI公司儀器，倒置顯微鏡Axio Vert A1為德國Zeiss儀器。

1.3 寨卡病毒RNA提取與核酸檢測 取血清、唾液和尿液標本或細胞培養物各200 μL，按照病毒RNA核酸提取試劑盒說明書提取病毒RNA，最后用50 μL洗脫液洗脫病毒核酸，-80 ℃冰箱保存。采用商品化寨卡病毒核酸檢測試劑盒進行核酸測定，按照說明書操作進行。

1.4 寨卡病毒分離鑒定 采用BHK-21和Vero細胞按照常規方法分離患者樣本中寨卡病毒。將細胞培養至單層，患者標本用維持液作適量稀釋后，接種細胞，置37 ℃ CO2培養箱培養。每日于倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)情況。每7 d傳代，盲傳3代，如無CPE視為陰性；有CPE則轉細胞瓶培養，待病毒增殖3/4的細胞發生病變時收取毒株進行熒光RT-PCR鑒定。

1.5 寨卡病毒空斑形成及病毒滴度測定 采用Vero細胞參照文獻方法[10]稍作改動進行噬斑試驗測定寨卡病毒滴度。用細胞維持液將寨卡病毒進行10倍倍比稀釋(10-1～10-7)，在單層致密Vero細胞的六孔培養板中加入不同稀釋倍數的病毒懸液，500 μL/孔，37 ℃吸附1 h，每隔15 min輕輕搖動1次以保證液體均勻覆蓋細胞面。吸附后棄病毒液，每孔加入3 mL瓊脂蓋(3%瓊脂糖和細胞維持液1∶1混合液)，37 ℃繼續培養，在顯微鏡下每日觀察細胞病變。觀察到明顯噬斑時加入0.5 mL固定液(4%甲醛)，37 ℃固定2 h，然后棄固定液和營養瓊脂蓋，并用去離子水清洗2～3次。加入1 mL 1.5%的結晶紫溶液，37 ℃染色0.5 h，棄結晶紫溶液，并用去離子水清洗2～3次，觀察形成的噬斑并計數，計算病毒空斑形成單位。

1.6 RT-PCR產物的擴增與序列測定 自行設計引物(表1)采用一步法RT-PCR擴增試劑進行寨卡病毒全基因組擴增，擴增產物送華大進行序列測定, 測序結果用DNASTAR Seqman軟件進行拼接以獲得全長基因組序列。

表1 本研究設計的擴增寨卡病毒基因組ORF引物Tab.1 Primers used for sequencing of ZIKV genome ORF in this study

1.7 序列分析與軟件 采用DNASTAR軟件MegAlign與GenBank數據庫中篩選到的寨卡病毒株進行全編碼區基因序列比對分析，用Mega6.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統進化樹，Bootstrap值設定為1000。

2 結 果

2.1 病例樣本寨卡病毒核酸檢測 使用商品化檢測試劑盒對不同時間段采集的患者血清、唾液和尿液樣本進行寨卡病毒核酸熒光RT-PCR檢測，患者血清、唾液和尿液樣本均有典型擴增曲線，其中尿液樣本Ct值約為22～35，唾液樣本Ct值約為29，血清樣本較弱，Ct值僅為35，且3種生物樣本病毒核酸陽性持續時間不一致，具體見表2。

表2 寨卡病毒病患者病程中生物樣本熒光RT-PCR和病毒分離結果Tab.2 Real time RT-PCR and virus isolation of biological samples from Zika virus patient in courses of disease

2.2 寨卡病毒分離鑒定 采用Vero和BHK-21細胞進行寨卡病毒分離。細胞盲傳3代，每代均連續觀察7 d。發現將唾液和尿液標本接種Vero細胞后第3代可觀察到肉眼可見的CPE，細胞病變主要表現為細胞圓縮且間隔變大、脫落(圖1)。提取Vero細胞第3代培養物進行寨卡病毒核酸檢測，熒光RT-PCR結果呈陽性。表明我們從患者唾液和尿液標本中成功分離到了寨卡病毒，分別將其命名為ZIKV/S/SZ1901和ZIKV/U/SZ1901。這也是我們首次成功從唾液和尿液標本中分離到寨卡病毒。而采用BHK-21細胞分離病毒時未見CPE，但提取BHK-21細胞第3代培養物進行寨卡病毒核酸檢測，熒光RT-PCR結果呈陽性，提示兩分離株可在BHK-21細胞中得到擴增。

注：a. Vero細胞對照；b. 唾液分離株ZIKV/S/SZ1901接種Vero細胞(p3代第4 d)；c. 尿液分離株ZIKV/U/SZ1901接種Vero細胞(p3代第4 d)圖1 寨卡病毒株感染Vero細胞的細胞病變作用(×200)Fig.1 Cytopathic effects(CPEs)of Zika Virus in Vero cells(×200)

注：a. ZIKV/S/SZ1901毒株接種Vero細胞的第三代細胞液的滴度3.4×105 PFU/mL；b. ZIKV/U/SZ1901毒株接種Vero細胞的第三代細胞液的滴度1.4×103 PFU/mL圖2 ZIKV/S/SZ1901和ZIKV/U/SZ1901毒株在Vero細胞的空斑形態Fig.2 Plaque morphology of ZIKV/S/SZ1901 and ZIKV/U/SZ1901 strains in Vero cells

2.3 寨卡病毒噬斑形態特征及病毒滴度 圖2所示，從唾液和尿液中分離到的寨卡病毒株均可在Vero細胞產生明顯的肉眼可見的空斑，空斑形態呈圓形，形態清楚，邊緣整齊。根據兩毒株稀釋度以及空斑數量計算空斑的形成單位(PFU/mL)以測定病毒滴度，結果顯示毒株在Vero細胞第3代培養液中的病毒滴度分別為3.4×105PFU/mL、1.4×103PFU/mL。

2.4 進化分析 為進一步對分離病毒的遺傳特征進行分析, 利用合成的全基因分段擴增引物(表1)針對Vero細胞培養病毒株, 分段對病毒全基因組進行了擴增, 將擴增的基因片段分別測序, 獲得了ZIKV/S/SZ1901和ZIKV/U/SZ1901病毒株的全長基因組序列。寨卡病毒唾液和尿液分離株兩者序列一致，全編碼區序列長度為10 272個堿基，編碼3 424個氨基酸(GenBank序列號為MZ008356)。將SZ1901與GenBank篩選到的36株寨卡病毒株(表3)構建進化樹顯示，SZ1901屬于亞洲基因簇系，與中國16個輸入性分離病毒株核苷酸序列同源性均在98.4%以上；與2016年中國貴州和2018年江西蚊媒標本中分離到的寨卡病毒株同源性均在98.6%以上；與近幾年東南亞分離株核苷酸序列同源性均在99.5%以上，其中與2017年從泰國輸入至日本的ZIKV/Hu/Thai/KngSG/17-D501株親緣關系最為接近，核苷酸同源性為99.6%，氨基酸同源性為99.8%；與1966年第1株分離自亞洲地區馬來西亞的寨卡病毒株P6-740核苷酸同源性為95.3%，氨基酸同源性為98.9%；與2010年從亞洲柬埔寨分離到的祖先寨卡毒株FSS13025核苷酸同源性為98.1%，氨基酸同源性為99.6%，見圖 3。此外，我們還發現SZ1901分離株寨卡病毒遺傳綜合征(Congenital Zika virus syndrome，CZVS)相關氨基酸變異位點分別為prM139(S)、E683(E)、E763(M)、E777(M)和NS5 2634(M)，且NS1基因為A188V的突變。

表3 用于進化分析的國內外寨卡毒株核苷酸序列信息表Tab.3 Nucleotide sequence information of Zika virus strains at home and abroad

圖3 寨卡病毒深圳分離株SZ1901全基因組進化樹圖Fig.3 Phylogenetic tree of full coding region of ZIKV SZ1901 strain

3 討 論

2019年12月9日，深圳海關報告1例從柬埔寨歸國的疑似寨卡病毒病患者，后經深圳市疾病預防控制中心和廣東省疾病預防控制中心逐級復核，遂被確診。根據流行病學史、臨床表現和實驗室檢測結果，廣東省衛計委10日晚通報發布該確診病例為2016年至今中國內地累計報告的第30例輸入性寨卡病毒病病例。寨卡病毒病的傳播媒介主要是埃及伊蚊，其次為白紋伊蚊、非洲伊蚊和黃頭伊蚊等[11]。深圳市廣泛分布白紋伊蚊，且與美洲、非洲、東南亞和太平洋島國等流行地區旅游、國際貿易和涉外勞務往來密切，一旦在夏秋季白蚊伊蚊密度高的時候出現輸入性病例，存在ZIKV本地傳播甚至引起局部聚集性病例的風險。因此，應加大對疫區歸國人員的宣傳教育，建立輸入性寨卡病例發現機制，提高實驗室檢測能力，才能有效控制寨卡病毒病疫情在我市擴散和暴發風險。

目前，寨卡病毒感染后癥狀不易與登革熱、基孔肯雅熱等區分，且由于寨卡病毒和登革病毒等黃病毒屬之間存在血清學交叉反應，實驗室鑒別診斷主要以病原學檢測(包括病毒分離培養和核酸檢測)為準。寨卡病毒的分離培養為診斷的金標準，但需時較長。因此常采用熒光RT-PCR方法快速進行寨卡病毒核酸檢測來對病例確診。患者入境時血清樣本寨卡病毒核酸檢測為弱陽性，這表明此時患者的病毒血癥期快要結束。而后通過對該病例的持續采樣檢測結果分析，唾液和尿液樣本中寨卡病毒載量較高，且尿液中的寨卡病毒比唾液和血液中存在時間長，這與既往文獻報道情況類似[12-15]。寨卡病毒病癥狀較輕，早期發現較困難；病例或隱性感染者被發現時大部分血清檢測寨卡病毒已經為陰性，因此建議除血清標本外應盡量同時采集唾液和尿液樣本開展核酸檢測以免漏檢。

寨卡病毒的分離培養通常采用C6/36、BHK-21和Vero細胞，樣本類型包括血清、唾液、尿液和精液，CPE情況和分離效果也各不相同。本研究常規采用Vero和BHK-21細胞進行寨卡病毒的分離，接種唾液和尿液標本后在Vero細胞上第3代第4 d觀察到出現典型的CPE，且可形成肉眼可見的空斑，與文獻報道一致[16-19]。而采用BHK-21細胞進行寨卡病毒分離時，盡管未觀察到CPE，但在BHK-21細胞第3代培養物中檢測到高滴度寨卡病毒核酸，可能因實驗室保存的BHK-21細胞代次較高，對寨卡病毒的敏感性降低，而寨卡病毒對Vero細胞更加敏感，具體影響因素有待于進一步深入研究。

從構建的進化樹可以看到，其中共有20條序列分離自中國，分為4個分支。研究表明寨卡病毒的分子進化與病毒的地理分布有著密切的關系。目前中國的寨卡病毒感染病例均為輸入性病例，分別來自南美洲、大洋洲、東南亞等地。其中SZ-WIV01、SZ01、SZ02、SMGC-1、Zhejiang04和ZJ03等分離自到薩摩亞旅游歸國的病例，與2016年中國貴州和2018年江西蚊媒標本中分離到的寨卡病毒株同源性較高，在同一個小分支上； GD01、GDZ16001、GZ01、GZ02、Z16019分離自南美洲如委內瑞拉到中國的輸入性病例，可能與有較多廣東人在南美務工以及去南美短期旅行有關；另一分支上云南報道的2019YNZIKV02[20]等分離自緬甸到中國的輸入性病例；而本次輸入性疫情的國家柬埔寨是寨卡病毒流行區，流行病學調查顯示，該病例為在柬埔寨居留期間感染的寨卡病毒，該病毒株SZ1901與2017年從泰國輸入至日本的ZIKV/Hu/Thai/KngSG/17-D501株高度同源，同屬于亞洲基因族系，在分子水平上進一步證實該病例為輸入性寨卡病例。文獻報道寨卡病毒基因組中5個氨基酸位點的替代(S139N、D683E、V763M、T777M、M/T2634V)與2015年以后流行的寨卡病毒引起寨卡病毒遺傳綜合征、吉蘭-巴雷綜合征等有關[18]。此外研究還發現病毒NS1蛋白第188位氨基酸由A變異為V可導致寨卡病毒的傳播和感染的增加[21]。此次分離株這6個氨基酸位點中E基因上3個位點和NS1第188關鍵位點發生變異，而prM和NS5基因關鍵位點未發生相應變異。寨卡病毒在人群中的大規模暴發正加速寨卡病毒的變異以更好地適應新宿主，其變異位點的功能值得重點關注，該毒株氨基酸變異位點是否導致其致病性和傳播效力等生物學特性發生變化仍未可知，但病毒基因的多樣性對寨卡的防控提出了挑戰，這也是我們下一步研究的重心。

綜上所述，本次疫情我們從患者流行病學史、臨床表現和實驗室檢測結果，確診該病例為從柬埔寨輸入性寨卡病毒感染病例。首次成功從唾液和尿液標本中分離到寨卡病毒，接著從細胞病變、空斑試驗等生物學特征對唾液和尿液分離株進行比較研究，發現不僅兩株病毒的敏感細胞以及病變時間存在差異，而且病毒株在Vero細胞的空斑形成單位不同。通過進一步的分子遺傳進化分析以及氨基酸位點差異比對，發現該寨卡病毒株具有引起寨卡病毒感染所致畸形綜合征等的分子基礎，同時也會造成蚊蟲寨卡病毒感染率增加，為深入了解病毒致病機制和研發安全有效的寨卡病毒疫苗和藥物奠定了基礎。

利益沖突：無

引用本文格式：陽帆，黃亞蘭，黃穗濱，等. 深圳市輸入性寨卡病毒分離株的進化分析及生物學特性研究[J].中國人獸共患病學報，2021，37(11)：977-984. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.143