林木種子休眠與萌發機制研究進展*

王艷梅 張小雪 朱秀征 張志華 李 志 耿曉東 蔡齊飛 劉 震

(河南農業大學林學院 中原地區森林資源培育國家林業和草原局重點實驗室 鄭州 450002)

休眠是植物為長期有效抵抗外界惡劣環境而產生的適應性，影響植物的分布時空(Wangetal.， 2019a)。種子休眠與萌發是林木生命活動中的關鍵發育步驟，在生物學和生態學上具有重要意義。種子休眠在一定程度上可降低同物種間的個體競爭(Finkelsteinetal.， 2008)，但這類種子只有解除休眠的狀態才能夠萌發，給種群的延續造成了困擾，給森林培育及遺傳育種帶來了挑戰。近年來，相關研究者對種子的休眠特性與萌發機制進行了大量研究并取得一些成果，為種子貯存、科學解除休眠提供了指導。

1 林木種子休眠

1.1 種子休眠定義

有關“種子休眠”目前仍存在爭議，Crocker(1916)提出“種子在生長被抑制之前或伴隨生長過程產生休眠”，并將自然條件下來年春季不能出苗的成熟種子稱為“二年種子”。Harper(1957)認為植物種子存在生長與休眠2種狀態，此觀點意味著種子在不發芽時是休眠的，但種子不發芽與休眠是顯著區別的2種現象(Vleeshouwersetal.， 1995)。種子休眠程度決定種子能夠發芽的條件范圍(Fenneretal.， 2005)。休眠的定義適用于種子休眠的具體情況(Graemeetal.， 1981)，但大多都是指“種子為植物提供的一種機制來延遲發芽，直到下一代生存的最佳條件”(Finkelsteinetal.， 2008)。一些林木種子的休眠是由胚胎周圍組織的機械屏障阻礙胚根正常發育而誘發的(Bewley， 1997a； 1997b)，但休眠并非是由不利的環境條件強加于種子的停滯發育狀態(Lietal.， 1997)。目前，種子休眠被廣泛認為是“有利環境下，具有生活力的種子仍不能萌發”的現象。

1.2 休眠的原因

1.2.1 環境因素 林木種子通過感知溫度來判斷外界環境變化。溫度信號參與調節種子酶促反應、呼吸作用等(秦愛麗等， 2020)，誘導種子休眠以及休眠的深度。不同林木種子休眠特性對溫度的響應不同，例如，板栗(Castaneamollissima)在貯藏期間，需要較低溫度(0～2 ℃)延長休眠期(王貴禧等， 1999)； 杉木(Cunninghamialanceolata)種子暴露在35 ℃條件下會產生二次休眠(Caoetal.， 2016)。

光通過作用于種子內的光敏因子在休眠中發揮重要作用。遠紅光條件相當于黑暗環境，有利于解除種子休眠，紅光相當于白光，可以延緩休眠解除，而白光中的藍光，能夠促進胚中ABA合成基因的表達，正調節種子休眠(李振華等， 2019)。

氧氣是種子內部代謝活動的動力。供氧不足時，種子內部營養物質轉化會受到抑制，并且種胚會因缺氧而產生休眠。紅松(Pinuskoraiensis)(Qietal.， 1993)、馬占相思(Acaciamangium)(符近等， 1997)、三藥檳榔(Arecatriandra)(楊期和等， 2005)等種子因種皮結構透氣性較差而產生休眠。

充足的水分能推動種子內部貯藏物質的轉化及細胞器的活化，是種子發育的動力。因此，環境濕度也會影響其休眠。

1.2.2 種子內源因素 種皮結構影響著種子透水性、通氣性以及透光性。酸豆(Tamarindusindica)(馬天曉等， 2012)、刺槐(Robiniapseudoacacia)(Naziretal.， 2014)、檜柏(Sabinachinensis)(馬拉青呼， 2019)、砂生槐(Sophoramoorcroftiana)(安毅鵬等， 2020)和頂果木(Acrocarpusfraxinfolius)(柯碧英等， 2020)等林木種子種皮堅硬或外包裹蠟質層，阻礙水分、氣體的交換從而誘導休眠。青錢柳(Cyclocaryapaliurus)(楊萬霞， 2004)、大山櫻(Prunussargentii)(王艷華等， 2005)等種子種皮對胚根伸長產生抑制作用，誘導休眠。

林木種子中可能含酚類、有機酸、生物堿及醛類等萌發抑制物，這些抑制物存在于種子不同部位，能夠阻礙種子吸水、改變滲透壓、抑制呼吸及酶活性等。黃檗(Phellodendronamurense)(Chienetal.， 2006)、三椏苦(Melicopepteleifolia)(魯強， 2019)等種子由于種皮存在抑制物或者被覆萌發抑制物而產生休眠。歐榛(Corylusavellana)(Pipinisetal.， 2020)、中泰南五味子(Kadsuracoccinea)(陳偉等， 2020)等果皮中含有抑制物； 青錢柳(楊萬霞， 2004)、紫椴(Tiliaamurensis)(高博等， 2015)、珊瑚樸(Celtisjulianae)(劉序， 2019)、三椏苦(Evodialepta)(魯強， 2019)、紫楠(PhoebeSheareri)(姜宗慶等， 2020)等種皮存在抑制物； 羊角槭(Aceryangjuechi)種子的內、外種皮與種胚均存在萌發抑制物質(陳香波等， 2017)，而三角槭(Acerbuergerianum)(肖志成等， 2008)、南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)(于海蓮， 2009)等種子的種胚含有抑制物。

種子種胚發育不成熟也可導致休眠。圓齒野鴉椿(Euscaphiskonishii)(游雙紅， 2013)、中泰南五味子(陳偉等， 2020)、長白楤木(Araliaelata)(范文麗， 2015)等種子成熟后，胚存在形態休眠(種胚尚未形成、胚分化尚不完善或種胚完成分化但體積很小)，仍需從胚乳或其他組織中吸收養料繼續生長，直到完成形態后熟； 三藥檳榔(楊期和等， 2005)、銅錢樹(Paliurushemsleyanus)(曹運梅等， 2019)、三椏苦(魯強， 2019)、頂果木(柯碧英等， 2020)等種子的種胚在形態上似已發育完全，但種胚的生理狀態不具備發芽條件，即生理后熟。而刺楸(Kalopanaxseptemlobus)(黃玉國等， 1990)、銀杏(Ginkgobiloba)(崔慧， 2017)等種子同時存在形態與生理后熟現象。

胚乳作為種子的營養組織對其休眠具有重要影響。在紫荊(Cercischinensis)種子發育過程中，胚乳細胞壁具有較高的機械強度，胚乳對胚生長的機械阻礙成為其休眠的重要因素(周健， 2016)； 南京椴(Tiliamiqueliana)種子胚乳細胞內物質代謝(楊艷華， 2009)及北五味子(Schisandrachinensis)(郎文香等， 2010)胚乳中內源抑制物是引起種子休眠的主要因素。

種子休眠的產生往往是多種因素共同作用的結果。青錢柳(楊萬霞， 2004)、黃檗(Chienetal.， 2006)、紫椴(高博等， 2015)、珊瑚樸(劉序， 2019)等種子是由于種皮結構密實且含有萌發抑制物質而誘導種子進入深度休眠狀態； 紅松(Qietal.， 1993)、三藥檳榔(楊期和等， 2005)等種子休眠是由于機械障礙及種胚發育不成熟誘導； 銅錢樹(曹運梅等， 2019)、頂果木(柯碧英等， 2020)等種子同時存在種皮障礙和生理后熟現象； 中泰南五味子果肉、種皮都存在抑制物且種胚發育不完整，是其休眠的原因(陳偉等， 2020)； 圓齒野鴉椿(游雙紅， 2013)、三椏苦(魯強， 2019)種子休眠原因比較復雜，不僅存在種皮結構障礙、含有萌發抑制物，并且種胚發育也不完全。

1.3 種子休眠類型劃分

植物種子的休眠種類繁多，針對這種復雜的生理現象，Crocker(1916)根據解除休眠的方法將種子休眠劃分為種皮不透水或不透氣、種皮的抑制作用、成熟的胚、胚內代謝失調、次生休眠、混合類型(其中2種或2種以上的組合)等7種類型。Villiers(1975)認為種子休眠可分為2種類型： 一是種子胚發育被外覆物抑制而休眠，二是胚本身特性誘發的休眠。Roberts等(1977)根據休眠出現期將種子休眠劃分為初生休眠、強迫休眠及次生休眠3類。Nikolaeva(1977)根據誘發種子休眠原因將休眠劃分為外源性、內源性休眠以及組合休眠，并且認為物理休眠(透水障礙)、機械休眠(胚外被覆物阻礙其生長)及化學休眠(含萌發抑制物)屬于外源性休眠，生理和形態休眠應劃分到內源性休眠的范疇。Fenner等(2005)在Roberts理論基礎上，將“強迫休眠”劃入了“次生休眠”的范疇，認為種子休眠有初生和次生休眠2種。陳偉等(2010)依據誘發休眠的部位將種子休眠分為胚休眠、種殼休眠和綜合休眠。潘琳等(2016)將種子休眠類型分為生理休眠(包括光信號、胚及抑制物等導致)和強迫休眠2類。Baskin等(2004)將種子休眠分為生理休眠、形態休眠、形態生理休眠、物理休眠以及綜合休眠5種類型。與Nikolaeva分類系統相比，Baskin等的分類方法將化學休眠、機械休眠劃入生理休眠范疇，是目前較全面的種子休眠類型劃分系統。

1.4 種子休眠機制

1.4.1 內源激素調控學說 內源激素的變化影響著植物響應環境的靈敏性，是調節植物(芽、種子等)生長發育的關鍵機制(王艷梅等， 2012),在植物生命活動中具有重要作用(房麗莎等， 2020)。Wareing等(1971)認為種子休眠由脫落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA)、細胞分裂素(cytokinin，CK)等激素決定。種子內部ABA水平影響休眠深度(Yanetal.， 2020)，并積極調控休眠的誘導及維持，ABA代謝及信號通路中相關基因調控種子休眠(表1)。種子處于休眠狀態時，有高水平的ABA以及較低水平的GA含量，GA通過其生物合成通路和信號轉導通路負向調控種子休眠(表2)； 而生長素(auxin，IAA)在其信號轉導過程中，通過增強種子對ABA的敏感性，正向調控休眠(表3)； 乙烯(ethylene，ETH)對種子休眠解除有一定的促進作用(康云清， 2016)(表4)。

表1 脫落酸代謝及信號通路中與種子休眠調控相關基因

續表1 Continued

表2 赤霉素代謝及信號通路中與種子休眠調控相關基因

表3 生長素代謝及信號通路中與種子休眠調控相關基因

表4 乙烯代謝及信號途徑中關鍵基因與種子休眠調控

另外，油菜素甾醇(brassinosteroids，BR)和細胞分裂素、水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)等激素也能夠通過ABA或GA的信號通路間接調控種子的休眠(Néeetal.， 2017)。因此，ABA、GA的生物合成與代謝控制著種子休眠產生以及休眠的深度，是種子休眠與解除的關鍵。

1.4.2 其他調控學說 光敏素(phytochrome，PHY)主要通過使基因活化或表達、調節某些酶的活性、改變細胞膜的透性、調控脫落酸和赤霉素代謝與信號基因的表達來影響休眠。PHY在感知光照及溫度信號時有不同分工： 作為光受體，PHY調控種子萌發受光波長及輻射強度的影響； 作為溫度受體，PHY受環境及種子吸脹溫度影響(李振華等， 2019)。

基因調控學說認為，基因調控種子的休眠過程是復雜的。ABA對基因組轉錄具有阻遏作用，影響DNA活性，并通過抑制特定類型mRNA的產生維持休眠(Wareingetal.， 1971)。種子在休眠過程中仍然進行核酸的代謝(藤伊正， 1980)，高濃度的ABA能夠抑制核酸的正常代謝，干擾核糖核酸RNA的合成，從而阻抑了蛋白質和有關酶的合成，使種子不能進行正常的代謝活動(鄭光華， 2004)。在休眠解除的初期，油松(Pinustabulaeformis)(周學權， 1989)、玉蘭(Yulaniadenudata)(楊孝漢等， 1991)種子RNA的合成受到翻譯水平的抑制，之后新RNA合成，DNA轉錄開始參與休眠的調節。

細胞膜相變論認為，溫度能夠通過影響細胞膜的狀態而調控種子休眠性。溫度升高，可能使細胞膜從凝膠態轉變為流體態，從而影響相關酶活性，并導致細胞膜透性變化和物質滲透，從而調控與種子休眠相關的代謝過程。

除此之外，還有學者提出呼吸途徑調節學說、代謝物調控途徑、Ca2+調節理論等來描述種子休眠的機理。

2 種子休眠解除方法與機制

2.1 激素解除休眠

種子由抑制物質起主要作用轉向促進物質占主導地位，是解除休眠的決定性因素。休眠解除過程受多種激素控制。長白楤木種子在貯藏過程中赤霉素3A(gibberellin A3，GA3)、ABA、玉米素核糖苷(zeatin riboside，ZR)、吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)4種激素的消長變化對種胚發育及休眠解除具有重要作用(范文麗， 2015)。Wang等(2018)研究山桐子(Idesiapolycarpa)種子休眠解除過程ABA、IAA、GA3和ZR水平的變化，發現IAA、GA3、反式玉米素核糖苷(trans-zeatin riboside，tZR)能夠有效促進種子休眠解除。ABA含量與GA3/ABA比值可能是解除休眠期的關鍵因素(Wangetal.， 2019b)，并且山桐子種子的發芽率與GA3/ABA 和(IAA+GA3+tZR)/ABA的比值均顯著相關(王艷梅等， 2018)。

2.2 層積解除休眠

種子經過層積處理一方面能夠增加種皮的透性，促進種子生理后熟； 另一方面可以減少萌發抑制物，從而調控種子內部激素水平向利于休眠解除與萌發方向發展。不同休眠特性種子，層積時所需溫度不同(劉震等， 2004； 王艷梅等， 2015)。新成熟的杉木(Caoetal.， 2016)、檜柏(馬拉青呼， 2019)、山茶(Camelliajaponica)(張寧等， 2015)等種子需要經過低溫層積解除休眠，獲得更高的發芽率及更快的發芽速度； 而山茱萸(Cornusofficinalis)種子需要變溫層積環境(洑香香等， 2013)。

2.3 化學物質解除休眠

利用酸、堿、過氧化物、含氮化合物等化學物質處理能夠破壞種皮來增加種皮透性打破種皮障礙、調節代謝或者降解萌發抑制物等解除種子休眠(魯強， 2019)。酸豆(馬天曉等， 2012)、刺槐(Naziretal.， 2014)、砂生槐(安毅鵬等， 2020)等一些由種皮包裹蠟質層或有其他被覆物導致休眠的種子，可以利用酸、堿液有效破除種皮障礙。

2.4 物理方法解除休眠

2.4.1 煙和熱解除休眠 燃煙中的一氧化氮(nitric oxide，NO)具有刺激植物萌發的作用(Keeleyetal.， 1997)； 煙中可溶解的氰醇類(cyanohydrins)，如氨基乙腈(glycoloni-trile) 、丙酮氰醇(acetone cyanohydrin)等通過緩慢釋放氰化物(cyanide)可以打破種子休眠狀態，刺激植物萌發。從燃煙中提取的化合物卡里金(karrikins，KAR1)達到一定濃度后可提高種子的萌發率(Flemattietal., 2004)。并且，植物對KAR1的響應依賴其休眠程度，需要經過后熟的植物對KAR1敏感性會更強。有些植物種子可能先需要合適的溫度和濕度打破休眠，增加對KAR1的敏感性，進而再促進萌發(周峰， 2013)。熱處理打破休眠的本質在于增加種皮的透氣性，解除休眠則需要根據種子類型施加不同溫度處理。

2.4.2 激光解除休眠機制 激光對生物體有一定的光壓作用，可通過電磁效應、光效應、熱效應和壓力效應等在一定范圍內對生物體、組織、細胞等產生極大的影響，導致種子內部生物能的改變，調控種子發育，從而促進休眠解除(李蓉等， 2005； 李宇赤等， 2019)。

2.4.3 物理損傷解除休眠 砂生槐(安毅鵬等， 2020)等“硬實”種子的休眠可利用去皮或劃破種子等物理方式，增加種皮透性打破機械束縛，以解除休眠。

3 林木種子萌發

3.1 萌發的定義

種子萌發通常指種子開始吸收水分(種子吸脹)，重新開啟代謝過程，胚根突破周圍結構完成萌發(Bewleyetal., 2013)。種子吸脹時種皮軟化，透氣性提高，并通過糖酵解途徑、三羧酸循環和磷酸戊糖等途徑進行呼吸作用，獲取能量，推動種子內部物理狀態發生變化，繼而在適宜環境下完成萌發。

3.2 激素調控種子萌發

激素通過其生物合成通路和信號轉導通路拮抗地調控種子萌發。ABA與GA通過抑制對方合成與分解代謝的基因而產生拮抗作用，由激素含量變化引起的種子發育過程中的生物發生，影響種子萌發狀態。與ABA相比，GA在種子休眠解除到萌發的過程中發揮主要作用(Finkelsteinetal.， 2008)，其通過消弱種皮障礙、弱化胚乳的束縛推動萌發；Auxin能夠負向調控種子萌發(帥海威等， 2016)； ETH可以促進種子種胚細胞的增長、胚軸伸長(康云清， 2016)，也能夠減輕ABA對萌發的抑制、與GA相互促進，在種子萌發中也很重要(方志榮等， 2007)； CK在種子萌發時，能夠減輕種子受逆境(干旱、鹽堿和重金屬等)脅迫程度，調控胚胎發育(宋松泉等， 2021)。除此外，BR、SA、JA等也能夠作用于ABA與GA的信號通路促進種子萌發(表5)。

表5 激素代謝及信號途徑中關鍵基因與種子萌發調控

續表5 Continued

3.3 miRNA調控種子萌發

在萌發階段，種子內部蛋白活性恢復，細胞中某些基因開始表達轉錄成信使RNA(Messenger RNA，mRNA)，這些mRNA與種子內部原本的貯藏mRNA開始翻譯與萌發有關的蛋白質。microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，參與種子發育、休眠與萌發等植物生命過程(魏俊等， 2017)，它通過和靶基因mRNA堿基配對，以降解mRNA或阻礙其翻譯進而抑制目標基因的表達，也可以直接切割目標mRNA調控種子萌發(表6)。miRNA在天女木蘭(Magnoliasieboldii)種子萌發時的表達集中在細胞生理、代謝等生物過程(魏俊， 2017)； 對銀杏種胚差異miRNA靶基因分析，發現其主要富集在激素信號、代謝通路、生物合成等途徑(何青松， 2018)。因此，miRNAs的差異表達特性在萌發發育中有重要調控作用。

表6 miRNA參與種子萌發調控功能

種子萌發與內部能量物質的代謝、激素信號啟動以及傳導等過程密切相關，除此之外，還受到轉錄翻譯、細胞伸長及活化、修復機制和細胞器重組等遺傳性因素的影響。

3.4 營養物質調控種子萌發

種子萌發是一個需能過程，這個過程涉及到營養物(碳水化合物、蛋白質、脂肪等)的分解以及能量的釋放(尹華軍等， 2004)。可溶性糖(葡萄糖、蔗糖)能夠通過糖酵解、磷酸戊糖途徑為種子萌發提供能量，并且能夠維持細胞滲透調節。可溶性糖開始下降，說明種子已經處于活躍狀態，開始消耗可溶性糖來進行萌發(張存虎， 2018)。在種子內部多種功能蛋白質中，貯藏蛋白與種子萌發關系是最為密切(岳佳銘等， 2021)。銀杏種子胚乳中的貯藏蛋白質是氮源的供應者，在種子萌發過程中，貯藏蛋白質被動員，降解為胚生長所需的營養物質(李生平， 2004)。淀粉作為重要的供能物質，經淀粉酶水解后，為種胚生長發育供能。高溫下，淀粉酶活性會受到抑制，導致紫椴種子中淀粉分解緩慢，可溶性糖和蛋白代謝也受抑制，導致種子難以正常萌發(段加玉等， 2013)。可溶性蛋白有利于增強種子的抗逆性，且在細胞滲透調節中具有重要作用，經相關酶降解后，有利于種子吸脹，為細胞分裂生長、種子發育提供所需能量。天女木蘭(劉月洋， 2010)、楨楠(Phoebezhennan)(龍漢利等， 2013)、珊瑚樸(劉序， 2019)等種子萌發過程中，可溶性蛋白、淀粉、可溶性糖等貯藏物質水平皆總體下降，為萌發供能。

3.5 活性氧分子調控種子萌發

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是在逆境下調節植物生長發育的一種重要的多功能信號分子(Qietal.， 2018)，在植物遭受逆境脅迫時，ROS會過度積累而導致植物的多種細胞成分氧化損傷，最終導致種子的萌發能力降低，而參與ROS調控通路又是種子降低氧化危害、應對逆境脅迫的重要策略(Chenetal.， 2014)。ROS對種子萌發的作用是間接的。對于馬檳榔(Capparismasaikai)(趙東興等， 2018)、美國無刺皂莢(Gleditsiatriacanthosvar.inermis)(劉婷等， 2018)、大葉女貞(Ligustrumlucidum)(賀桂蘭， 2020)等一些種皮透氣性差的種子，使用過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)可以軟化種皮，降低種皮對胚生長的束縛作用，促進萌發。SA和H2O2共同處理玉米能顯著提高內源SA和H2O2的含量，且與GA生物合成相關的基因ZmGA20ox1和ZmGA3ox2會表達上調，與GA分解代謝相關的ZmGA2ox1基因表達會明顯下調，進而降低種子萌發抑制基因ZmRGL2的表達，促進種子萌發(Lietal.， 2017)。ABA抑制種子的萌發可能與ABA的降解增加H2O2的積累量有關(Anandetal.， 2019)，而ROS又能通過轉錄效應來刺激GA的生物合成(Lietal.， 2018)。以上研究表明，ROS通過調節激素代謝來調控種子萌發。因此，保持種子內部ROS含量的平衡對種子萌發非常重要。

4 種子休眠與萌發

休眠與萌發是種子2個不同的發育階段，既存在聯系又相互區別。休眠能夠決定種子發芽所需的條件，當給予適宜的外部環境后，解決種子自身產生的抑制作用便可以引起萌發。這2個步驟的核心是ABA/GA平衡： 成熟種子處于休眠狀態時，ABA和IAA含量高，GA含量低； 種子萌發時，其他激素也能夠影響 ABA與GA的生物合成與代謝信號通路，激素間相互作用可以精確控制種子休眠與萌發(圖1)。

圖1 種子休眠解除與萌發過程

5 結論與展望

種子休眠與萌發受遺傳因素和環境因素的控制，是植物生長發育進程中的2個關鍵環節。目前，對少數植物種子休眠與萌發的機制已有較為清晰的認識，尤其在激素信號調控休眠與萌發方面，已取得重大進展。種子休眠與萌發的機制在不同植物中具有一定的保守性，但單、雙子葉植物間及不同植物間存在一定的特異性。與模式植物及一些農作物、園藝作物相比較，林木生長周期長，相關的遺傳基礎和分子機制尚不清楚，有關其林木種子休眠解除與萌發機制研究不夠完善，林木種子休眠與萌發的分子機制仍知之甚少，林木種子休眠與萌發的探究仍是林學研究的難點。因此，今后可在以下幾方面進行深入研究： 1)自然萌發率低的木本植物種子休眠、萌發機制； 2)影響種子休眠和萌發的因素之間是如何相互作用的，尤其激素和環境對不同休眠類型的種子休眠和萌發的調控； 3)多角度多學科交叉探討種子休眠與萌發過程中發生的生理生化代謝反應和分子信號轉導網絡； 4)更多蛋白互作的體內證據，調控林木種子休眠與萌發的差異基因的篩選、主效基因挖掘及其功能分析。