扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞增殖、遷移及旁分泌能力的影響

欒玉玲，花東明，陳相波，王芳，孔曉妮，馮煜

扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞增殖、遷移及旁分泌能力的影響

欒玉玲1，花東明1，陳相波2，王芳1，孔曉妮1，馮煜1

1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海 200120；2.杭州榮澤生物科技集團有限公司，浙江 杭州 311200

觀察扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞（HUCMSCs）增殖、遷移及旁分泌能力的影響。貼壁法分離HUCMSCs，流式細胞術鑒定HUCMSCs表型并檢測其分化能力；取第5代HUCMSCs，隨機分為空白血清組及5%、10%、15%藥物血清組，CCK-8法檢測HUCMSCs增殖能力；克隆形成實驗檢測HUCMSCs增殖能力；劃痕實驗檢測HUCMSCs遷移能力，測量劃痕寬度并計算細胞遷移率。Transwell實驗檢測HUCMSCs遷移能力，統計遷移細胞數目。ELISA檢測HUCMSCs旁分泌堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）能力。分離培養的HUCMSCs高表達標志物CD90（99.8%）、CD105（97.1%）、CD73（99.9%）、CD44（100%），符合HUCMSCs表型特征并具有成脂/成骨分化功能。CCK-8結果顯示，5%、10%、15%藥物血清干預HUCMSCs后，均能促進HUCMSCs增殖（＜0.05）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs克隆形成數量增加。劃痕實驗和Transwell實驗結果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組干預后，HUCMSCs遷移率明顯升高（＜0.01），且隨藥物血清濃度增加，細胞遷移率呈上升趨勢。ELISA結果顯示，與同一時點空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs旁分泌bFGF能力明顯增強（＜0.05）。扶正化瘀方藥物血清對HUCMSCs增殖、遷移和旁分泌bFGF能力有明顯促進作用。

扶正化瘀方；人臍帶間充質干細胞；細胞增殖；細胞遷移；旁分泌

肝纖維化是肝臟對反復慢性炎癥、壞死等損傷無效修復后形成的瘢痕組織，隨著其程度加重，最終發展為肝硬化甚至肝癌。目前尚無特效藥物進行治療，臨床以肝移植術作為終末期肝病唯一有效的治療手段，但供體缺乏及免疫排斥限制其廣泛應用[1]。人臍帶間充質干細胞（HUCMSCs）移植術作為治療肝纖維化的有效方案，其臨床有效性不斷得到證實[2-3]。但HUCMSCs在體外誘導增殖效率低、生物學功能易受培養環境影響，及其向肝臟遷移能力低等仍是亟待解決的問題[4]。扶正化瘀方可顯著改善慢性丙型肝炎患者肝功能及肝纖維化程度[5]?；A研究表明，扶正化瘀方可降低肝纖維化小鼠肝纖維化程度[6]。但扶正化瘀方能否通過增強HUCMSCs功能發揮對肝纖維化的治療作用，目前尚無相關研究。本研究采用血清藥理學方法，觀察扶正化瘀方藥物血清對體外培養的HUCMSCs增殖、遷移和旁分泌能力的影響，以期為終末期肝病的臨床治療提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠20只，12周齡，體質量200～250 g，浙江維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（浙）2019-0001，動物使用許可證號SYXK（滬）2020-0009。飼養于溫度20 ℃、相對濕度60%環境，12 h明暗交替，自由飲水。實驗前禁食12 h。動物實驗經上海中醫藥大學動物倫理委員會審批（PZSHUTCM201106014）。

1.2 藥物

扶正化瘀方浸膏粉（丹參4 g，桃仁2 g，絞股藍6 g，松花粉2 g，冬蟲夏草菌絲8 g，五味子2 g），由上海黃海制藥有限責任公司提供。使用前稱取適量扶正化瘀方浸膏粉，加入蒸餾水攪拌溶解，配制成濃度為0.24 g/mL溶液。質控標準：每24 g扶正化瘀方浸膏粉中丹酚酸B不少于15.6 mg、丹參素鈉不少于13.2 mg、五味子乙素不少于2.28 mg、冬蟲夏草菌絲腺苷不少于4.8 mg。

1.3 主要試劑與儀器

Transwell培養小室（美國Costar，貨號3422），CCK-8檢測試劑盒（英國Abcam，貨號ab228554），成脂染色試劑盒（美國Cyagen，貨號HUXUC-90031），成骨染色試劑盒（美國Cyagen，貨號HUXUC-90021），堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）ELISA試劑盒（上海酶聯生物，貨號ml026040），HUCMSCs標志物檢測試劑盒（美國BD公司，貨號562245），胎牛血清（FBS，美國Gibco公司，貨號10091155），DMEM/F12培養基（美國Gibco公司，貨號10565042）。生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司，型號BHC-1300ⅡA/B2），臺式低速離心機（德國Eppendorf公司，型號5702R），多功能酶標儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司，型號分別為TC20、Gel Doc XR+），二氧化碳培養箱（美國Thermo公司，型號311），流式細胞儀（美國BD公司，型號CNL17-A0009），倒置顯微鏡（德國Leica公司，型號DMI3000B），電子天平（德國Sartorious公司，型號CP2251）。

2 實驗方法

2.1 人臍帶間充質干細胞分離與鑒定

HUCMSCs取自正常分娩產婦，采用傳統貼壁法，嚴格按照無菌操作分離HUCMSCs[7]：將臍帶剪成0.5～0.8 cm，置于含10%FBS的DMEM/F12培養液中培養12 d，換液去除漂浮組織，待貼壁細胞≥80%時開始傳代，傳至第3代后進行后續實驗。選取第5代細胞，將細胞懸液移入流式管中，加入熒光染料標記細胞，常溫避光孵育15 min，流式細胞術檢測CD90、CD105、CD73、CD44，鑒定HUCMSCs表型。

2.2 成脂誘導分化能力和成骨誘導分化能力檢測

取對數期HUCMSCs，按3×105個/孔接種至6孔板，每孔加入2 mL完全培養基（DMEM/F12＋10%FBS），待細胞生長至60%～70%時，更換成2 mL成脂/成骨誘導分化培養基，每隔3 d換新鮮的成脂/成骨誘導分化培養基，誘導3周后，4%多聚甲醛室溫固定，加入油紅O/茜素紅染料染色[8]，顯微鏡下觀察有無脂肪小滴或鈣結節。

2.3 藥物血清制備

將20只大鼠隨機分為藥物血清組和空白血清組，每組10只。根據人與大鼠體表面積計算給藥劑量，藥物血清組灌胃2.52 g/kg扶正化瘀方溶液，2次/d，連續3 d。末次灌胃后1 h行腹主動脈采血，室溫靜置2 h，3 000 r /min離心15 min，吸取血清，0.22 μm濾膜過濾除菌，56 ℃孵育30 min滅活，置于-20 ℃冰箱保存備用。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力

取第5代HUCMSCs，以1×103個/孔接種于96孔板。將細胞分為空白血清組和5%、10%、15%藥物血清組，每組5個復孔，常規培養過夜后，空白血清組加入15%空白血清，5%藥物血清組加入5%藥物血清和10%空白血清，10%藥物血清組加入10%藥物血清和5%空白血清，15%藥物血清組加入15%藥物血清，置于培養箱中培養24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶標儀波長450 nm處檢測各孔吸光度（OD值）。

2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

將細胞懸液以1×103個/孔接種至6孔板，分別加入相應血清培養14 d，多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色20 min，觀察克隆形成數量。

2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將HUCMSCs以3×105個/孔接種至6孔板，分別加入相應血清培養24 h，使細胞鋪滿6孔板，用10 μL槍頭借助直尺進行快速劃痕。PBS洗滌細胞3次，加入無血清培養基[9]培養12 h，顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并獲取圖像，Image J軟件分析劃痕寬度并計算細胞遷移率。細胞遷移率（%）＝實驗后劃痕寬度÷實驗前劃痕寬度×100%。

2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

HUCMSCs分別用不同血清培養24 h，收集各組細胞，進行細胞計數，取5×104個細胞，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用無血清培養基重懸細胞，接種至Tranwell小室上室；將含20%FBS的培養基加入Tranwell小室下室，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h[10]。多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察，統計遷移細胞數目。

2.8 ELISA檢測細胞旁分泌堿性成纖維細胞生長因子能力

將HUCMSCs以3×105個/孔接種至6孔板，加入不同血清培養24、48 h，收集細胞上清液，加入96孔板中，每孔加入酶標試劑0.1 mL，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌5次，37 ℃避光顯色，酶標儀波長450 nm處測量各孔OD值。以空白孔調零，計算細胞上清液中bFGF含量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 人臍帶間充質干細胞形態、表型鑒定

臍帶培養24 h后可見少量貼壁細胞，72 h全換液后，貼壁細胞明顯增多；細胞傳至第5代時，呈短梭形、紡錘形貼壁細胞逐漸增多（見圖1），局部可形成小的集落，即HUCMSCs克隆。應用流式細胞術分析HUCMSCs表面標志物，結果顯示，HUCMSCs高表達標志物CD90（99.8%）、CD105（97.1%）、CD73（99.9%）、CD44（100%），符合HUCMSCs表型特征。

圖1 第5代HUCMSCs形態（×200）

4.2 人臍帶間充質干細胞分化能力鑒定

成脂誘導分化3周后，油紅O染色顯示，細胞胞質中脂滴被染成橘紅色。成骨誘導分化3周后，茜素紅染色顯示，細胞內鈣質沉淀被染成紅色，表明HUCMSCs具有多向分化潛能。見圖2。

圖2 HUCMSCs成脂成骨分化鑒定（×200）

4.3 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結果顯示，5%、10%、15%藥物血清培養細胞24、48、72 h能促進HUCMSCs增殖（＜0.05，＜0.01），見表1?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組細胞克隆形成數量明顯增加，見圖3。

表1 各組HUCMSCs不同時點增殖能力比較（±s，OD值）

注：與同一時點空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

圖3 各組HUCMSCs克隆形成數量比較

4.4 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組細胞遷移率明顯升高（＜0.01），其中，10%、15%藥物血清促進HUCMSCs遷移作用更明顯（＜0.01），見圖4、表2。Transwell實驗結果顯示，與空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組遷移細胞數目顯著增加（＜0.01），且隨藥物血清濃度增加，遷移細胞數目增加（＜0.01），見圖5、表3。

圖4 各組HUCMSCs遷移能力比較（劃痕實驗，×100）

表2 各組HUCMSCs劃痕實驗細胞遷移率比較（±s，%）

注：與空白血清組比較，**＜0.01；與5%藥物血清組比較，##＜0.01

圖5 各組HUCMSCs遷移能力比較（Transwell實驗，×40）

表3 各組HUCMSCs Transwell實驗遷移細胞數目比較（±s，個）

注：與空白血清組比較，**＜0.01；與5%藥物血清組比較，##＜0.01

4.5 扶正化瘀方藥物血清對人臍帶間充質干細胞旁分泌堿性成纖維細胞生長因子能力的影響

與同一時點空白血清組比較，5%、10%、15%藥物血清組HUCMSCs旁分泌bFGF能力升高，差異有統計學意義（＜0.05），見表4。

表4 各組HUCMSCs旁分泌bFGF能力比較（±s，pg/mL）

注：與同一時點空白血清組比較，*＜0.05，**＜0.01

5 討論

作為間質干細胞的異質性亞群，HUCMSCs具有免疫調節特性，可遷移至受損肝組織與肝細胞融合，或轉分化為肝細胞，發揮對肝纖維化的治療作用，并可通過旁分泌作用分泌可溶性因子，改善纖維化瘢痕區域的微環境，延緩纖維化進程[4，11-12]。但HUCMSCs臨床應用存在的問題限制了其發展，如HUCMSCs在體外誘導增殖時增殖率較低，隨著培養環境的改變其自我更新能力逐漸喪失，導致體外培養的HUCMSCs失去部分生物學功能。另外，干細胞在治療肝臟疾病時，存在歸巢于肝臟能力低等問題。

肝纖維化屬中醫學“肝積”范疇，《金匱要略》有“虛勞之人，陰陽傷損，血氣凝澀，不能宣通經絡，故積聚于內也”的記載?；谄洹梆鲅獌冉Y、正氣虛弱”的病機，上海中醫藥大學總結出治療肝硬化的臨床經驗方扶正化瘀方，該方由冬蟲夏草菌絲、桃仁、丹參、絞股藍、五味子、松花粉組成，以具有活血化瘀作用丹參作為君藥；桃仁助丹參活血化瘀，冬蟲夏草益精氣補虛勞共為臣藥；松花粉、絞股藍益氣健脾同為佐藥；五味子味酸，作為使藥引經入肝。丹參主要成分丹酚酸B可促進細胞增殖，降低細胞凋亡率[13]。桃仁可減輕血管內皮生長因子（VEGF）表達，增強Bcl-2表達，抑制內皮細胞凋亡[14]。冬蟲夏草菌絲可上調解耦聯蛋白2表達，下調腫瘤壞死因子-α表達，發揮保護肝臟的作用[15]。絞股藍主要成分絞股藍皂苷可阻斷AGEs-RAGE氧化應激信號通路，通過降低細胞上清液丙二醛水平、增加細胞內谷胱甘肽水平，降低細胞氧化應激水平[16]。

扶正化瘀方在緩解臨床癥狀、改善肝纖維化程度及并發癥等方面療效顯著[11]。同時，可抑制肝星狀細胞活化及增殖，減輕肝組織脂肪變、炎癥及纖維化程度，抑制誘導型一氧化氮合酶表達，減輕氧化應激反應及肝細胞損傷，改善肝臟微循環及肝組織缺氧狀態；也可通過抑制Kupffer細胞表達VEGF，阻止新生血管形成，促進肝竇毛細血管化逆轉[17-19]。本研究進一步探討了扶正化瘀方藥物血清對HUCMSCs增殖、遷移及旁分泌能力的影響，結果表明，扶正化瘀方藥物血清可提高HUCMSCs體外增殖、遷移及旁分泌bFGF能力。bFGF作為一種多肽分子，可促進HUCMSCs生長，且經bFGF處理的HUCMSCs在改善肝損傷程度及肝纖維化方面效果更顯著[20]。以上研究結果可為扶正化瘀方結合干細胞治療肝臟疾病的臨床應用提供實驗依據。

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Effects ofDecoction Contained Serum on Proliferation, Migration and Parapocrine Capacity of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

LUAN Yuling1, HUA Dongming1, CHEN Xiangbo2, WANG Fang1, KONG Xiaoni1, FENG Yu1

To investigate the effects ofDecoction contained serum on the proliferation, migration and paracocrine ability of human umbilical cord mesenchymal stem cells (HUCMSCs).HUCMSCs were isolated by adherence method. The phenotype and the differentiation ability of HUCMSCs were examined by flow cytometry. The fifth generation of HUCMSCs were randomly divided into blank serum group, 5%, 10% and 15% drug-contained serum group, CCK-8 method was used to detect the proliferation ability of HUCMSCs. The proliferation ability of HUCMSCs was detected by clone formation experiment. The migration ability of HUCMSCs cells was detected by scratch adhesion test. Transwell assay was used to detect the migration ability of HUCMSCs. The ability of HUCMSCs to paracrine bFGF was detected by ELISA.The high expression markers of CD90 (99.8%), CD105 (97.1%), CD73 (99.9%) and CD44 (100%) in isolated and cultured HUCMSCs were consistent with the phenotypes of mesenchymal stem cells and had the ability of osteogenic and adipogenic differentiation. CCK-8 results showed that 5%, 10% and 15% drug-contained serum could promote the proliferation of HUCMSCs (<0.05). The clone formation experiment showed that, compared with the control group, the number of cell clone formation significantly increased in the 5%, 10% and 15% drug-contained serum groups. Scratch adhesion test and Transwell assay results showed that, compared with the control group, the migration rate of HUCMSCs cells in 5%, 10% and 15% drug-contained serum groups significantly increased (<0.01), and the cell migration rate showed increased trend with the increased drug-contained serum. The ELISA result showed that, compared with the control group at the same period, the ability of HUCMSCs to paracrine bFGF in 5%, 10% and 15% drug-contained serum group increased (<0.05).Decoction contained serum can significantly promote the abilities of proliferation, migration and paracrine bFGF of HUCMSCs.

Decoction; human umbilical cord mesenchymal stem cells; cell proliferation; cell migration; paracrine ability

R285.5

A

1005-5304(2021)12-0056-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104350

國家自然科學基金（81873582）；上海中醫藥大學“研究生創新培養”專項科研項目（3489）

馮煜，E-mail：davisfy@126.com

（2021-04-19）

（修回日期：2021-05-02；編輯：鄭宏）