原花青素對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、遷移及TLR4/MyD88通路的影響

楊 靖，謝 群

（襄陽市中心醫院整形美容科 湖北 襄陽 441000）

瘢痕疙瘩是皮膚傷口愈合的病理反應，其特征是成纖維細胞的異常增殖和膠原的過度沉積，臨床表現為創面邊緣外的持續性腫瘤樣增生和鄰近組織侵犯。瘢痕疙瘩的復發率高，許多治療方法包括切除和病灶內注射皮質類固醇療效不令人滿意。因此，亟需尋找有效治療瘢痕疙瘩的藥物。原花青素是從植物中提取出的生物類黃酮，具有強抗炎和抗氧化作用，最早作為抗肝纖維化的藥物進行研究，但對瘢痕疙瘩的作用研究尚未報道。在纖維化的發病過程中，靜息狀態下的造血干細胞在外界因素的刺激下被激活轉化為成纖維細胞，并合成和分泌大量的細胞外基質成分(Extracellular matrix components，ECM)，導致纖維化。臨床研究表明，纖維化通常伴有血清炎性細胞因子水平升高。此外，越來越多的研究表明，脂多糖激活的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)信號通路在纖維化中起重要作用。TLR4可通過髓樣分化因子88（MyD88）蛋白激活核轉錄因子κB（Nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路，誘導炎癥反應。而炎癥反應可導致細胞增殖增加，使細胞凋亡紊亂，進一步促進纖維化的發展。因此，本研究檢測原花青素對瘢痕疙瘩成纖維細胞(Keloid fibroblasts，KFs)增殖和遷移的影響，并探討TLR4/MyD88通路在整個過程中的作用，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供理論依據。

1 資料和方法

1.1 主要試劑與儀器：原花青素（中國醫學科學院藥物研究所）；KFs細胞（中國科學院上海細胞庫）；胎牛血清和DMEM培養液（美國Hyclone公司）；四噻唑藍（MTT）（美國Amresco公司）；（Annexin）V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；白介素-23（Interleukin-23，IL-23）、白介素-17A（Interleukin-17A，IL-17A）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）(南京建成生物工程研究所）；Trizol（美國Invitrogen公司）；mRNA反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術公司）；TLR4、MyD88、NF-κB和β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記的IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；ECL化學發光液（美國GE公司）；CO細胞培養箱和NanoDrop2000c型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司）；HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；Real-time PCR擴增儀（美國ABI公司）；流式細胞儀和垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 細胞的培養和原花青素的半數抑制濃度的確定：在37℃、5%CO的條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養KFs細胞，當KFs細胞貼壁達到70%左右時進行實驗。將KFs細胞接種于96孔板中（5×10個/孔），待細胞貼壁后用不同濃度的原花青素（0、5、10、20、40、80、160mg/L）干預KFs細胞干預20h后加入MTT（20微摩爾/孔），37℃繼續培養4h，離心棄上清液，每孔加入200μl二甲基亞砜，振蕩10min，用酶標儀測定吸光度值（OD值），計算細胞增殖率[細胞增殖率=（實驗組OD值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）]，確定原花青素的半數抑制濃度。

1.3 細胞分組：實驗將96孔（5×10個/孔）已培養好的KFs細胞隨機分為對照組、原花青素低劑量組、原花青素中劑量組和原花青素高劑量組,每組24孔（5×10個/孔）。對照組細胞不進行處理；原花青素低、中、高劑量組分別用終濃度為25、50、100mg/L的原花青素干預KFs細胞，24h后進行相關檢測。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預KFs細胞24h后收獲細胞，分別加入5μl膜聯蛋白（Annexin）V-FITC與碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20min，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 細胞劃痕法檢測細胞遷移能力：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后，使用100μL移液管的尖端刮擦每個培養板中的細胞層，以劃出傷口；將細胞用磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS）沖洗劃痕，參照1.3中所述干預KFs細胞24h后從每個劃痕傷口中隨機選擇5個視野，用顯微鏡下拍照，用圖像分析儀測量劃痕寬度。

1.6 酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）檢測細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后參照1.3中所述干預KFs細胞24h后收獲細胞，加入2ml磷酸鹽緩沖液，用細胞超聲破碎儀處理30s，離心取上清，按試劑盒說明書檢測細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平。

1.7 實時熒光PCR（Real-time fluorescence -PCR，RTPCR）檢測細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA表達：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預KFs細胞24h后收獲細胞，加入TRIzol進行總RNA提取，根據mRNA反轉錄試劑盒說明書，將總RNA轉化為cDNA，根據熒光定量PCR試劑盒說明，用制備20ul反應體系，反應條件：93℃預變性40s；93℃變性10s，62℃退火1min，72℃延伸45s，共循環50次，最后一個循環后72℃延長7min，采用2法計算TLR4、MyD88和NF-κB mRNA的相對表達量（以β-actin作為內對照）。

1.8 Western Blot法檢測KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達：將KFs細胞接種于6孔板中（1×10個/孔），待細胞貼壁后按1.3干預KFs細胞24h后收獲細胞，用PBS洗滌兩次，加入RIPA 裂解液（100μl），裂解2h（4℃）離心取上清，得到總蛋白，采用BIO-RAD濕轉系統SDS-PAGE 膠進行電泳（20微克/孔），切膠、轉膜、封膜后將膜與TLR4（1∶200）、MyD88（1∶400）、和NF-κB（1∶500）進行孵育，過夜（4℃），用辣根過氧化物酶標記的IgG（1∶5 000）在室溫下孵育（30min），滴加ECL化學發光液進行顯色，采集圖像進行分析（以β-actin作為內對照）。

2 結果

2.1 原花青素對KFs細胞增殖的影響：隨著原花青素濃度增加，KFs細胞增殖率降低，與0μmol/L比較，差異有統計學意義（＜0.05）。當原花青素濃度為40mg/L時，KFs細胞增殖率為41.53%，當原花青素濃度為80mg/L時，KFs細胞增殖率為30.68%，故選50mg/L作為半數抑制濃度（見圖1）。

圖1 原花青素對KFs細胞增殖的影響

2.2 原花青素對KFs細胞凋亡和遷移的影響：與對照組比較，其余各組細胞遷移距離降低，細胞凋亡率依次增加，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞凋亡率和遷移距離呈劑量反應關系，差異具有統計學意義（＜0.05）(見表1，見圖2～3)。

表1 原花青素對KFs細胞凋亡和遷移的影響 （）

圖2 原花青素對KFs細胞凋亡的影響

圖3 原花青素對KFs細胞遷移的影響

2.2 原花青素對KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響：與對照組比較，其余各組細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平呈劑量反應關系，差異具有統計學意義（＜0.05）(見表2)。

表2 原花青素對KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平的影響（）

2.3 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響：與對照組比較，其余各組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平呈劑量反應關系，差異具有統計學意義（＜0.05）(見表3)。

表3 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB mRNA水平的影響（）

2.4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB 蛋白水平的影響：與陰性對照組比較，其余各組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平降低，且隨著原花青素劑量增加，各原花青素劑量組細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平呈劑量反應關系，差異具有統計學意義（＜0.05）(見表4，圖4)。

表4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響（）

圖4 原花青素對KFs細胞中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平影響

3 討論

創傷組織修復涉及多種病理機制，包括炎癥、組織形成和組織重塑。盡管瘢痕疙瘩是一種良性疾病，但它會侵襲鄰近的正常組織，甚至破壞其正常功能，被認為是良性增生性皮膚腫瘤。KFs細胞在細胞增殖、遷移和侵襲中表現異常，并逃避細胞凋亡，在ECM中不成比例地積聚，是臨床治療瘢痕疙瘩的主要難題。炎癥微環境是腫瘤相關炎癥的一個標志。慢性炎癥誘導DNA損傷和突變，導致腫瘤的形成和進展。IL-23是IL-12家族成員，是一種異源二聚體促炎細胞因子，主要由炎性髓細胞產生。IL-23在IL-6和轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）存在的情況下，刺激T細胞分化為Th17細胞，能夠產生另一種促炎細胞因子IL-17A。IL-17A招募中性粒細胞，促進樹突狀細胞成熟，并刺激巨噬細胞產生IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），然后誘導和介導炎癥反應。越來越多的研究表明IL-23/IL-17A軸參與腫瘤的生長和轉移。此外，IL-23/IL-17A軸可減少CD8+細胞在腫瘤中的浸潤，增強調節性T細胞的免疫抑制活性。研究表明，瘢痕疙瘩是慢性炎癥長期作用的結果。原花青素具有抗炎、抗氧化和抑制血管生成等藥理作用，具有廣泛的應用前景，但其藥效學基礎尚不清楚。本研究結果顯示，原花青素顯著抑制KFs細胞中IL-23、IL-17A和IL-6水平，同時抑制KFs細胞增殖和遷移，誘導細胞凋亡。

TLR4作為一個重要的信號轉導受體，在多種類型的人類癌癥中過度表達，如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌。TLR4通過識別病原體相關分子模式(Pathogen associated pattern molecules，PAMPs)，如LPS，從而誘導炎癥細胞因子的分泌并激活先天免疫系統，抑制TLR4/MyD88通路激活可減弱TLR4與LPS的結合，從而下調下游信使分子和相關炎癥基因的表達。同時，TLR4/myd88通路的激活促進了腫瘤的發生和轉移。本研究結果顯示，原花青素干預能劑量依賴性地抑制了KFs細胞中TLR4和MyD88的表達，表明原花青素的抗炎作用與TLR4/MyD88通路有關。

慢性炎癥與纖維化密切相關。在纖維化患者中發現LPS水平升高，LPS激活TLR4通路被證明參與了纖維化的發展。轉化生長因子β激活1(Transforming growth factor β-activated kinase 1，TAK1)蛋白是TLR4通路中的關鍵蛋白，可激活NF-κB信號通路。轉錄因子NF-κB通路一直被認為是一種典型的促炎信號通路，其主要作用在于上調促炎基因的表達。NF-κB p65和p50亞基組成一個異源二聚體，由LPS等刺激激活通常被定義為典型的NF-κB通路。NF-κB p65/p50異二聚體通常被NF-κB抑制劑（IκBα）隔離在細胞漿中，在LPS刺激下，IκBα被磷酸化和降解，釋放p65/p50異源二聚體轉運到細胞核并結合NF-κB共識位點，激活炎癥反應。TLR4/MyD88通路介導NF-κB的激活以及隨后的促炎性細胞因子（包括IL-1β、IL-6和TNF-α）的產生。這些細胞因子刺激髓樣樹突細胞分泌IL-23，從而促進Th17細胞的增殖和分化。IL-23由p19和p40單元組成，而p19的誘導呈TLR依賴性。本研究結果顯示，TLR4/MyD88通路調節KFs細胞中NF-κB表達水平，從而調控IL-23和IL-17A的表達水平。

綜上所述，原花青素可能通抑制TLR4/MyD88通路的激活，降低KFs細胞中炎癥因子水平，抑制KFs細胞增殖和遷移，同時促進KFs細胞凋亡，為原花青素治療瘢痕疙瘩提供了一種新的策略。但仍需進行體內實驗，評價其臨床應用治療瘢痕疙瘩的有效性和安全性。