《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》標準中蛋白質含量的檢測方法研究

于浩　姜愛莉　李敏　付步芳　王召旭

[摘要]目的：建立整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品中蛋白質含量的標準檢測方法，為行業標準YY/T 0962-2014《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》的修訂提供實驗依據。方法：采用酸解法處理樣品，考察了酸的種類、酸解時間等影響因素，用0.5mol/L硫酸溶液且在（95±5）℃恒溫干燥箱45min中將樣品完全溶解，利用考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合顯色的原理，以牛血清白蛋白為對照品，采用分光光度法在波長595nm處測定樣品中蛋白質的含量，且委托第三方三所實驗室對方法進行驗證，對數據結果進行雙因子方差分析。結果：該方法專屬性較高，蛋白濃度在2～10μg/ml，回歸方程y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），校正曲線的線性關系良好，樣品測定重復性RSD均值為3.19%，回收率結果98.70%，檢出限為0.96μg/ml，四所實驗室對同批次樣品進行測定，采用雙因子方差分析，得到P值為0.253>0.05，認為不同實驗室采用同一方法對同批次樣品的蛋白測定結果不存在顯著性差異。結論：該方法是一種簡單、快速、準確測定整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品中蛋白含量的檢測方法。

[關鍵詞]交聯透明質酸鈉凝膠;考馬斯亮藍法;蛋白質含量;注射整形;質量控制

[中圖分類號]R318? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）10-0006-04

Study on the Detection Method of Protein Content in the Standard of Cross-linked Sodium Hyaluronate Gel for Plastic Surgery

YU Hao1，2，JIANG Ai-li1，LI Min1，2，FU Bu-fang2，WANG Zhao-xu2

（1.Yantai University，Yantai 264000，Shandong，China;2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 102629，China）

Abstract： Objective? To establish a standard detection method for protein content in cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery， and to provide experimental basis for the revision of industry standard YY/T 0962-2014 Cross-linked sodium hyaluronate gel for plastic surgery. Methods? The sample was treated by acid hydrolysis method， and the influencing factors such as the type of acid and acid hydrolysis time were investigated. The sample was completely dissolved in a 0.5mol/L sulfuric acid solution and （95±5）℃ constant temperature oven for 45min. The principle of blue G-250 combined with protein for color development， used bovine serum albumin as a control， used spectrophotometry to determine the protein content in the sample at a wavelength of 595nm， and entrusted three laboratories to the method perform verification and perform two-way ANOVA on the data results. Results? The method has high specificity， protein concentration in the range of 2-10μg/ml， regression equation y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）， the linear relationship of the calibration curve is good， and the average RSD of the sample measurement repeatability was 3.19%， the recovery rate was 98.70%， and the detection limit was 0.96μg/ml. The four laboratories measured the same batch of samples and used a two-factor analysis of variance to obtain P= 0.253>0.05. It was considered that there was no significant difference in the protein determination results of the same batch of samples by the same method in different laboratories. Conclusion? This method is a simple， rapid and accurate method for determining the protein content of cross-linked sodium hyaluronate gel products for plastic surgery.

Key words： cross-linked sodium hyaluronate gel; coomassie brilliant blue method; protein content; injection plastic; quality control

透明質酸（Hyaluronan，Hyaluronic acid，HA）是一種廣泛分布在軟結締組織細胞外基質中的線狀聚陰離子酸性黏多糖，具有維持皮膚穩定以及保持皮膚彈性的功能[1]。1995年，HA類皮膚填充劑通過歐盟批準首次進入歐洲市場，2003年，被美國食品藥品監督管理局（Food and drug administration，FDA）正式批準用于整形美容行業，一般用于修復皮膚褶皺，通過外部充填而達到理想的美容效果[2]。通常選擇交聯技術，使產品具有更強的抗酶解性能和良好的流變學性能等，以達到理想的使用周期[3]。該類產品具有生物相容性較好、安全性較高以及應用多樣化等優勢，受到整形美容行業青睞[4]。國家藥品監督管理局網站中可查詢到進口的注射用交聯/修飾透明質酸鈉凝膠的注冊證共23個。

現行的行業標準YY/T 0962-2014《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》于2014年發布，2015年開始實施。隨著技術的發展，目前該標準的部分內容和指標已經不能適應行業的進步與發展。例如，HA中蛋白質含量是必須嚴格控制的，蛋白質含量高于1%時，機體易產生抗原反應，往往會出現過敏現象[5]。現行標準中僅對HA原料中的蛋白含量有所要求（不得高于0.1%），未對交聯透明質酸鈉凝膠中的蛋白含量進行控制。在由HA到交聯透明質酸鈉凝膠的生產過程中，還需要堿化、透析等多步工藝，過程繁瑣且耗時較長，有可能接觸新的蛋白質污染源，從而使產品中的蛋白質含量發生改變，因此不能簡單的用原料中的蛋白質含量來推算產品中的蛋白質含量。筆者建立了交聯透明質酸鈉凝膠產品中蛋白質含量的測定方法，采用酸解工藝對產品進行處理，并探索出合適的酸解條件，如所用酸的種類，酸解時間等，然后采用考馬斯亮藍法對蛋白質進行測定。

1? 資料和方法

1.1 儀器和試劑：數控超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司，型號：VGT-2120QTD，頻率：40kHz）;電子分析天平（深圳市盛美儀器有限公司，型號：XSE205DU）;紫外-可見分光光度計（日本日立公司，型號：日立U-3310）。

交聯透明質酸鈉凝膠樣品（樣品1批號：H181217A11C;樣品2批號：36923128;樣品3批號：20190102;樣品4批號：H190123B11A;樣品5批號：H181219A11A）;磷酸（≥85%，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181019，分析純）;95%乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170103，分析純）;鹽酸（36%～38%，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20181009，分析純）;硫酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150429，分析純）;考馬斯亮藍G250（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20160114，分析純）;牛血清白蛋白（≥98%，北京欣經科生物技術有限公司，批號：B76636，分析純）。

1.2 實驗方法：考馬斯亮藍法和福林酚法是兩種常見的蛋白質含量測定方法，考察了這兩種方法對本產品的適用性。

1.2.1 考馬斯亮藍法：在酸性環境中，考馬斯亮藍G-250染料與蛋白質中的堿性氨基酸（尤其是精氨酸和賴氨酸）以及芳香族氨基酸的殘基通過疏水力相結合，最大吸收峰由465nm變為595nm[6]。蛋白質濃度1～1 000μg/ml，蛋白質-染料復合物在595nm的吸光度與蛋白含量成正比，故可用于蛋白質含量的測定，原理如圖1。

1.2.1.1 溶液的配制：考馬斯亮藍染色液：稱取考馬斯亮藍G-250 100mg，加95%乙醇50ml，待考馬斯亮藍溶解后（可使用超聲），再加85%磷酸100ml，純化水定容至1 000ml，混勻，濾過，取濾液即得。本染色液應置棕色瓶內，宜配制24h后使用。如有沉淀生成，使用前需經濾過。

對照品溶液：稱取0.010g牛血清白蛋白于100ml容量瓶，稀釋10倍至濃度約10μg/ml。

0.5mol/L硫酸：加入適量純化水于1L容量瓶中，取硫酸27.2ml于容量瓶中，繼續加純化水定容混勻。

1.2.1.2 標準曲線系列濃度溶液：準備6只潔凈棕色具塞比色管，取上述標準儲備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml于具塞比色管中，分別加1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0ml純化水，混勻得到系列濃度的標準品。

1.2.1.3 實驗最佳條件的選擇：稱取交聯透明質酸鈉凝膠2.000g，置20ml頂空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，壓緊瓶蓋，置（95±5）℃恒溫干燥箱45min，使之完全溶解。冷卻至室溫后，將頂空瓶中溶液轉移至10ml棕色容量瓶，用3.0ml 1mol/L氫氧化鈉溶液潤洗頂空瓶，將潤洗液轉移至容量瓶，純化水定容至10.0ml，從中吸出1.0ml置棕色試管中，在標準液系列各試管和樣品試管中分別加入考馬斯亮藍G-250染料試劑5.0ml，小心渦旋混勻，室溫下反應5min，以空白溶液作參比，595nm波長處測定吸光度。

酸解時間：為考察酸解時間對樣品酸解效果的影響，分別設置30min、45min和60min的酸解時間點，其他操作按照1.2.1.3的實驗方法進行。

酸性環境：考馬斯亮藍G-250染料在試劑配制過程中需加入磷酸溶液，起到調節pH的作用，使考馬斯亮藍溶液呈酸性。后期測定之前可加入50μl磷酸以調節酸性環境，對是否補加磷酸做對比實驗，考察磷酸的影響，其他操作按照1.2.1.3的實驗方法進行。

酸的選擇：交聯透明質酸鈉凝膠酸解通常采用硫酸或鹽酸，分別考察了兩種酸的適用性，為驗證蛋白質在1mol/L鹽酸溶液和0.5mol/L硫酸溶液中95℃條件下是否被破壞，分別加入高中低三個濃度的蛋白質標準品溶液，進行回收率試驗的測定，其他操作按照1.2.1.3的實驗方法進行。

1.2.1.4 線性關系考察：以牛血清白蛋白對照品溶液的濃度（μg/ml）為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，在蛋白濃度2～10μg/ml范圍內繪制標準曲線。

考馬斯亮藍法按如下公式計算交聯透明質酸鈉凝膠中蛋白質的含量：

E=（a×V）/m

1.2.1.5 精密度：取樣品1適量，按照1.2.1.3的實驗方法，連續進行6次分析，記錄吸光度值，并計算相對標準偏差（Relative standard deviation， RSD）。

1.2.1.6 穩定性：取樣品2適量，按照1.2.1.3的實驗方法，每隔5min進行一次檢測，30min內進行7次分析，記錄吸光度值，并計算RSD。

1.2.1.7 重復性：平行取樣品2、樣品3和樣品4適量，各6份，按照1.2.1.3的實驗方法，分別進行測定，記錄吸光度值，計算含量及RSD。

1.2.1.8 加標回收率：分別稱取3份2.000g樣品5置20ml頂空瓶中，加0.5mol/L硫酸溶液3.0ml，不加振蕩，分別加入40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml牛血清白蛋白標準溶液各1.0ml后，壓緊瓶蓋，置（95±5）℃恒溫干燥箱中45min，使之完全溶解。冷卻至室溫后，將頂空瓶中溶液轉移至10ml容量瓶，用3.0ml 1mol/L氫氧化鈉溶液潤洗頂空瓶，將潤洗液轉移至容量瓶，最后純化水定容。平行制備3份，然后同1.2.1.3的實驗方法進行測定，并計算對應的加標回收率及RSD。

1.2.1.9 檢出限：連續進行10次空白測試，按公式計算檢出限：

1.2.2 福林酚法：標準曲線系列溶液的配制和樣品的制備同考馬斯亮藍法，操作步驟按照2020版中國藥典中福林酚法的要求進行[7]。

1.2.3 多所實驗室驗證：就起草驗證工作進行了安排和分工，就工作時間結點與驗證工作組成員進行了確認，由本單位進行方法建立，即中國食品藥品檢定研究院（實驗室Z），組織國內多所具有檢測資質的實驗室對該方法進行驗證，包括杭州協合醫療用品有限公司（實驗室X）、北京蒙博潤生物科技有限公司（實驗室M）以及愛美客技術發展股份有限公司（實驗室A），采用考馬斯亮藍法，按照1.2.1.3 的實驗方法開展同一方法的驗證工作，對同批次樣品1、樣品3進行蛋白質含量的測定，采用Minitab 16對數據進行統計學處理，對其進行雙因子方差分析。

2? 結果

2.1 考馬斯亮藍法

2.1.1 實驗最佳條件的選擇

2.1.1.1 酸解時間：選擇30min、45min、60min三個樣品酸解時間。30min時，可以看到頂空瓶中有明顯顆粒，沒有酸解完全，未進行下一步操作。加熱45min和60min后頂空瓶中的樣品完全酸解，未發現顆粒物質，兩個加熱時間的蛋白含量測定結果分別是13.209μg/g、13.734μg/g，結果差距不大，且在45min時酸解效果已穩定，故選擇45min為樣品的最終酸解時間。

2.1.1.2 酸性環境：在標準液系列各試管和供試品試管中分別加入50μl磷酸，再分別加入考馬斯亮藍G-250染料試劑5.0ml進行蛋白含量測定時，回歸方程為：y=0.0079x-0.0014（r=0.9981），未補加磷酸的回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997）。由表1數據可知，補加磷酸后的方法線性相對較差且吸光度明顯變小，故選擇測定之前無需加入磷酸的方法。

2.1.1.3 酸的選擇：采用1mol/L鹽酸溶液對交聯透明質酸鈉凝膠樣品進行消解后，回歸方程為：y=0.0104x-0.0090（r=0.9972），平均回收率為112.10%，RSD為6.74%，回收率偏高;采用0.5mol/L硫酸溶液的回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），平均回收率為98.70%，RSD為7.68%。并且考慮到鹽酸溶液存在揮發的可能，故將鹽酸溶液換成硫酸溶液。

2.1.2 線性關系考察：標準曲線見圖2，回歸方程為：y=0.0125x-0.0033（r=0.9997），對照品含量在2～10μg/ml的濃度范圍內線性關系良好，表明蛋白質在此濃度范圍內與吸光度之間符合Lamber-Beer定律。

2.1.3 精密度：連續進行6次分析，吸光度值分別是0.030、0.030、0.031、0.029、0.030、0.031，RSD為2.50%，可知方法精密度良好。

2.1.4 穩定性：每隔5min進行一次檢測，30min內進行7次分析，吸光度值分別是0.023、0.026、0.025、0.024、0.024、0.024、0.023，RSD為4.43%，可知該方法在30min內樣品顯色穩定。

2.1.5 重復性：對樣品2、樣品3、樣品4分別進行6次重復測定，由表2數據可知，RSD均值為3.19%，可知方法重復性良好。

2.1.6 加標回收率：設定3個加標梯度，數據結果見表2～3，計算得出，該方法的平均回收率為98.70%，RSD為7.68%，表明方法測量準確度良好。

2.1.7 檢出限：10次空白測定吸光度值分別為：0.078、0.074、0.083、0.072、0.077、0.083、0.078、0.080、0.079、0.072，空白測定標準偏差為0.0040，標準曲線斜率為0.0125，根據公式計算檢出限，結果為0.96μg/ml。

2.2 福林酚法：采用福林酚法測定結果，回歸方程為：y=0.0120x-0.0138（r=0.9997），線性關系雖然良好，但該種方法樣品管加入顯色劑后，顏色有干擾。

2.3 多所實驗室驗證結果：四所實驗室按照1.2.1.3的實驗方法對樣品1、3進行蛋白含量測定，采用Minitab 16對數據進行統計學處理，采用雙因子方差分析，顯著水平P=0.253>0.05，因此得出多所實驗室對樣品1、3的測定結果不存在顯著性差異，結果表明該方法測定整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品中的蛋白質含量具有可行性和可靠性。見表4。

3? 討論

對考馬斯亮藍法和福林酚法的檢測結果和理論機制進行分析，福林酚法的檢測結果明顯高于考馬斯亮藍法，考慮到前者的干擾因素很多，包括酚類、多肽、硫酸銨等，而交聯透明質酸鈉凝膠樣品中存在除蛋白以外的多肽類雜質，檢測過程中也會和福林酚發生反應，造成結果偏高，認為該方法不適用于整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠中蛋白質含量的測定。

交聯透明質酸鈉凝膠不溶于水，需要溶解后才能將交聯網絡中殘留的蛋白質釋放出來，同時還需不影響蛋白質的測定。酸水解不充分，凝膠中的蛋白質不能完全溶出;水解過度可能會使樣品中的蛋白質水解成單體氨基酸或低分子肽（考馬斯亮藍試劑不與單體氨基酸及相對分子量小于3kDa的多肽結合[8]），影響結果準確性。采用考馬斯亮藍法，對酸解條件進行優化，考察了酸的濃度以及酸解時間等因素，最終確定了0.5mol/L硫酸溶液3ml，在（95±5）℃恒溫干燥箱消解45min的酸解條件。該方法穩定性和重復性較好，精密度和準確度較高，且通過四所實驗室開展同一方法的驗證工作，對其檢測數據進行雙因子方差分析，測定結果不存在顯著性差異，得出本次建立的整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠產品中蛋白質含量的測定方法具有可行性和可靠性，可作為標準檢測方法推廣應用。

在實驗操作過程中忽視某些細節也會直接影響反應結果，例如考馬斯亮藍G-250與石英比色皿（成分為二氧化硅）產生強烈的結合，因此本實驗建議使用玻璃或塑料比色皿;考馬斯亮藍分子結構對光照敏感，光照強烈會使顯色劑吸收光譜發生改變，造成檢測結果出現較大波動，因此需采用棕色試劑瓶且避光測定[9];考馬斯亮藍染色液在配制時，應先加入考馬斯亮藍G-250粉末和乙醇，必須保證考馬斯亮藍G-250溶解后再加磷酸（可使用超聲），最后用純化水定容在棕色容量瓶中，24h后使用效果更佳，使用前需過濾;稱取交聯透明質酸鈉凝膠時，需置于頂空瓶的底部，避免沾到瓶壁影響酸解，加入硫酸后，需輕拿輕放，勿搖晃頂空瓶;此外，在檢測時效上，時間因素對復合物穩定性的影響較為顯著，因此需兩人配合測定吸光度以加快速度，保證時間的一致性。

致謝：在此，十分感謝杭州協合醫療用品有限公司、北京蒙博潤生物科技有限公司、愛美客技術發展股份有限公司以及相關領域專家對YY/T《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》行業標準的修訂內容和補充驗證情況做出的努力，對該行業的發展具有重要意義。

[參考文獻]

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[收稿日期]2020-08-20

本文引用格式：于浩，姜愛莉，李敏，等.《整形手術用交聯透明質酸鈉凝膠》標準中蛋白質含量的檢測方法研究[J].中國美容醫學，2021，30（10）：6-10.