PET 瓶無菌線培養(yǎng)基模擬灌裝的取樣數(shù)與污染率問題研究

陸健鋒 張琪 謝駿琦 周衛(wèi)林

無菌灌裝是指在無菌環(huán)境下，將滅菌后的液態(tài)物料及包裝材料完成灌裝和封口的過程。與高溫熱灌裝相比，無菌灌裝采用嚴格的過程控制，在可能會引起微生物污染的位置加強無菌狀態(tài)的保持，無需添加防腐劑，無需二次殺菌就可以達到商業(yè)無菌［1,2］，同時降低PET 的克重，并在瓶型設計方面具有更大的靈活性。培養(yǎng)基模擬灌裝是無菌驗證的核心內(nèi)容，是指在無菌驗證中，以培養(yǎng)基替代生產(chǎn)介質(zhì)，模擬實際產(chǎn)品生產(chǎn)過程，并通過培養(yǎng)基的最終染菌率來評估無菌保證能力。

無菌的概念

無菌是指不含任何微生物，從定義上來說，是一個絕對的概念。一旦將無菌定義為絕對無微生物污染，那么就無法用科學的方法來驗證，從而無法建立起可以應用的技術標準，因此我們需要的無菌概念是科學的、安全的，最重要是可驗證的。無菌產(chǎn)品的安全性要求設定相對的無菌標準。

物理或化學滅菌方法的殺滅曲線是遵循對數(shù)規(guī)則的，即意味著一批滅菌物品中可能有一定概率的活微生物未被殺滅或除去［3］，所以無菌性在概率意義上定義為污染低到可接受的程度，一般用無菌保證值SAL（Sterility Assurance Level）表示。USP24 版〈1211〉的滅菌及滅菌保證提到：最終滅菌產(chǎn)品的SAL 要求小于百萬分之一。無菌灌裝產(chǎn)品的 SAL 要求小于千分之一。飲料行業(yè)所說的無菌屬于“商業(yè)無菌”概念，商業(yè)無菌是指經(jīng)過適度的殺菌后，產(chǎn)品不含有致病性微生物，也不含有在通常溫度下能繁殖的非致病性微生物［4］。

灌裝取樣數(shù)

培養(yǎng)基灌裝是無菌檢查的一種特殊形式。灌裝數(shù)量可看作取樣數(shù)量，將直接影響無菌檢查的可信度。

在培養(yǎng)基灌裝檢查發(fā)現(xiàn)污染的概率公式：

Q=1-（1-p）n

Q—未通過無菌檢查的概率

n 取樣數(shù)

P 產(chǎn)品污染率（與生產(chǎn)工藝提供無菌保證的能力有關）通過兩項式展開法來評價產(chǎn)品污染率（%）和取樣數(shù)對無菌檢查污染率（%）的影響，見表1：

表1.

從計算可以看出，產(chǎn)品的污染率越低，通過無菌檢查判斷批產(chǎn)品無菌的可信度越差。如表1 所示，0.2%污染率的產(chǎn)品，當取樣數(shù)為 100 時，誤將產(chǎn)品判為合格的概率為 81.9%。如圖1 所示，同樣的取樣數(shù)，污染率越低，誤將產(chǎn)品判為合格的概率越高。如圖2 所示，在對產(chǎn)品污染控制比較高的情況下，加大取樣數(shù)，提高的可信度也是微不足道的。增加取樣數(shù)時，無菌操作污染的風險也會增加，因此，過多地增加取樣數(shù)并不是保證產(chǎn)品無菌驗證準確性的合理路徑。

圖1

圖2

通常情況下，確定培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量考慮以下兩個主要因素：一是應符合統(tǒng)計學要求，即在95%的置信區(qū)間，且至少能檢出千分之一的污染率［5］；二是被驗證工藝過程覆蓋日常實際生產(chǎn)批量。因為實際生產(chǎn)批量與無菌工藝操作所持續(xù)的時間和灌裝速度密切相關，而培養(yǎng)基灌裝的持續(xù)時間應足以涵蓋實際生產(chǎn)條件下的全部操作，并且培養(yǎng)基的灌裝數(shù)量應能反映出在等于或小于實際生產(chǎn)的灌裝速度下產(chǎn)品及容器所暴露時間的“最差狀況”［6,7］。飲料行業(yè)不同于制藥企業(yè)，灌裝設備無菌保持時間通常為72小時，以實際運行產(chǎn)能24000 瓶/時的灌裝設備單批量計算達到1728000瓶。如果以該數(shù)量定為培養(yǎng)基模擬灌裝量，那么將大幅增加企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，飲料行業(yè)在無菌驗證時，培養(yǎng)基模擬灌裝取樣數(shù)通常為30000 瓶，并且分三輪，在生產(chǎn)初始、中間、末尾進行灌裝取樣，目的是為了盡可能地覆蓋一個無菌周期。

污染概率

FDA 規(guī)定了無菌灌裝方法的無菌安全程度為10-3，因此，培養(yǎng)基灌裝污染率的極限值是0.1%。FDA 工業(yè)指南《用無菌工藝生產(chǎn)的無菌藥品—現(xiàn)行良好生產(chǎn)方法》有關無菌制劑工藝模擬驗證合格標準如下：

1. 灌裝少于 5000 支時， 不應檢出污染品

2. 灌裝在 5000 至 10000 時：

(1) 1 支污染需進行調(diào)查， 并考慮重復培養(yǎng)基灌裝試驗

(2) 2 支污染需進行調(diào)查， 并可即視作再驗證的理由

3. 灌裝超過 10000 支時：

(1) 1 支污染需進行調(diào)查

(2) 2 支污染需進行調(diào)查， 并可即視作再驗證的理由

根據(jù)歐洲飲料機械工業(yè)協(xié)會（Association of the Beverage Machinery Industry）公布的無菌驗證協(xié)議：低酸性產(chǎn)品的無菌驗證分3 輪進行，每輪10000 瓶，每輪≤1 瓶的染菌被視為無菌驗證的可接受標準。培養(yǎng)基灌裝污染率是無菌檢查的一項重要參數(shù)，當某一條無菌生產(chǎn)線通過培養(yǎng)基模擬灌裝測試，代表該生產(chǎn)線達到商業(yè)無菌［8］。

無論在醫(yī)藥還是食品行業(yè)，無菌技術應用于生產(chǎn)領域已有幾十年的歷史，隨著科技的飛速發(fā)展以及相關應用技術不斷提高，無菌技術越來越成熟、可靠。同時，食品安全性和營養(yǎng)功能性受到廣泛重視，低碳高效的無菌技術在未來具有廣闊的發(fā)展空間。