基于Notch1/ROR-γt信號通路研究芹菜素對自身免疫性甲狀腺炎小鼠的保護作用

李澤壟，李智奇，喻濤

（深圳市龍華區人民醫院甲乳外科，廣東深圳 518109）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是一種臨床上常見的自身免疫功能紊亂所引起的甲狀腺疾病[1]。其病因復雜且臨床癥狀多樣，有研究報道AIT 的致病機制涉及炎癥、凋亡和氧化損傷等[2-3]。AIT 患者的主要臨床癥狀有甲狀腺腫大、功能減退以及纖維化等[4]。特別是近年來隨著生活方式的逐漸改善以及生活環境的惡化，AIT 的發病率有明顯上升的趨勢[5]。臨床使用抗AIT 藥物品種較多，如糖皮質激素、左旋甲狀腺素、雷公藤多苷片等。雖然AIT 病患可獲得某些癥狀的改善，但存在藥物使用的其他問題不容忽視，如服后不良反應多和斷藥易復發等[6]。故開發新的替代藥物仍是當務之急。

芹菜素，別稱為芹黃素或洋芹素，是一種廣泛存在于各種水果和蔬菜、豆科植物以及茶葉中的黃酮類化合物，其中在芹菜中的含量最高，已有較多的研究[7]表明芹菜素具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調節、抗癌、抗病毒等多種生物活性。基于以上特性，芹菜素是否對自身免疫性甲狀腺炎具有良好的保護作用目前尚未見相關研究報道。本實驗通過建立小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型，從炎癥、氧化應激和凋亡角度，探討其對自身免疫性甲狀腺炎的影響。

1 材料

1.1 動物

60只SPF的雌性BALB/c小鼠，體質量18～22 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCⅩK（粵）2019-0002。

1.2 藥品與試劑

芹菜素（質量分數≥98%，陜西慧科植物開發有限公司）；雷公藤多苷片（10 mg/片，貴州漢方藥業有限公司）；PTg、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑（Sigma公司）；碘化鈉（NaI，金錦樂化學有限公司）；小鼠TPOAb 化學發光試劑盒、小鼠TGAb 化學發光試劑盒（上海安妍生物有限公司）；TNF-α、IL-1βELISA 檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；SOD、MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；Bcl-2、Bax單克隆抗體（北京博奧生物）。

1.3 主要儀器

800TS 吸收光酶標儀（美國Biotek 伯騰公司）；IⅩ71 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；JYD-325型輪轉切片機（金華市宇典醫療器械廠）；WD-9413C型凝膠成像分析系統（福州申輝化工儀器設備有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型構建

參照文獻[8]方法構建動物AIT 模型，將PTg 與完全弗氏佐劑按體積比1∶1 制成油包水乳劑，制備質量濃度為0.25 mg/mL的溶液。按50 μg/只的劑量從動物背部皮下選取多個注射點注射上述自制的乳劑，給藥1 次/周，給藥周期為2 周。從第3 周開始注射由不完全弗氏佐劑聯合PTg 乳化的油包水乳劑，制備質量濃度為0.25 mg/mL 的溶液，給藥劑量和頻次同上，給藥周期為3周，每周的注射部位分別為背部皮下、頸部皮下以及腹腔，每日正常自由飲用高碘水，質量濃度為0.63 mg/mL，構建小鼠AIT模型。

2.2 分組與給藥

實驗分為6 組：空白對照組、模型組、雷公藤多苷片組、芹菜素低、中、高劑量組，每組10 只。造模后灌胃給藥，其中雷公藤多苷片組給藥劑量為5 mg/（kg·d），芹菜素低、中、高劑量組的給藥劑量分別為[15、30、60 mg/（kg·d）]，而空白對照組和模型組給予等量0.9%NaCl 溶液，1 次/d，共14 d。

2.3 檢測指標

實驗完成后，小鼠摘眼球取血，靜置4 ℃冰箱2 h，3 500 r/min 4 ℃冷凍離心5 min，小心分離血清并-80 ℃保存備用。酶聯免疫法分別檢測血清中TGAb、TPOAb的水平。ELISA酶聯免疫法檢測TNF-α和IL-1β水平。化學發光法檢測血清SOD 活性和MDA 含量。小心分離小鼠甲狀腺組織，10%（φ）中性甲醛溶液浸泡固定左側甲狀腺組織，用于石蠟包埋、切片和HE 染色，觀察甲狀腺病理學變化。Western blot 法檢測右側甲狀腺組織勻漿Bcl-2和Bax的蛋白含量。

2.4 統計學方法

利用SPSS 17.0 軟件，計量資料以表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平

與空白對照組比較，模型組小鼠血清TGAb 和TPOAb水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清TGAb 和TPOAb水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清TGAb 和TPOAb 水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組小鼠血清TGAb和TPOAb水平Figure 1 Levels of TGAb and TPOAb in serum of mice in each group()

3.2 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量

與空白對照組比較，模型組小鼠血清SOD 活性明顯降低（P＜0.01），MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清SOD 活性明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA含量明顯降低（P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清SOD活性明顯升高（P＜0.05），MDA 含量明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠血清SOD活性和MDA含量Figure 2 SOD activity and MDA content in serum of mice in each group()

3.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平

與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組小鼠血清TNF-α和IL-1β水平Figure 3 Levels of TNF-α and IL-1β in serum of mice in each group()

3.4 各組小鼠甲狀腺組織病理學觀察

空白對照組小鼠甲狀腺組織中腺泡呈立方狀，間質厚度正常，無炎癥細胞浸潤，腺泡腔內的膠質分布均勻（圖4A）。模型組小鼠甲狀腺結構異常，濾泡間隔厚薄不一，大量炎癥細胞浸潤（圖4B）。相對模型組，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組以上癥狀有不同程度的改善，可見甲狀腺濾泡間隔變薄，炎癥細胞浸潤減輕，其中芹菜素高劑量組和雷公藤多苷片組改善效果最好（圖4C-F）。

圖4 各組小鼠甲狀腺組織病理學觀察（HE染色，200×）Figure 4 Histopathological observation of thyroid tissue of mice in each group(HE staining,200×)

3.5 各組小鼠甲狀腺組織Bcl-2、Bax、Notch1 和ROR-γt蛋白的表達水平

與空白對照組比較，模型組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達量顯著降低（P＜0.01），而Bax、Notch1 和ROR-γt 蛋白的相對表達量顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素給藥組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而Bax、Notch1和RORγt 蛋白的相對表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，芹菜中，高劑量組Bax相對表達下降（P＜0.05，P＜0.01）。與芹菜素低劑量組比較，雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的相對表達量顯著升高（P＜0.05），而Notch1 和ROR-γt 蛋白的相對表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組小鼠甲狀腺組織Bcl-2、Bax、Notch1和ROR-γt蛋白的表達水平Figure 5 Expression levels of Bcl-2,Bax,Notch1 and ROR-γt in Thyroid tissues of mice in each group()

4 討論

AIT 是免疫系統功能紊亂、環境以及遺傳等多種因素綜合作用所引起的一種自身免疫性疾病。近年來研究發現除免疫功能紊亂外，炎癥、氧化損傷和凋亡等機制共同參與該病的發生發展。目前，以動物皮下多點注射豬甲狀腺球蛋白聯合高碘水的方法建立的AIT 動物模型較為常見，該模型不僅能較好地模擬AIT的主要癥狀，而且操作簡單、模型復現性好，受到較多的科研工作者青睞[9]。近年來，隨著中醫藥研究的不斷深入，特別在抗AIT藥物發掘方面取得了一定的進展。如雷公藤多苷片，其主要用于類風濕性關節炎、腎病綜合征和系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的治療，最近研究表明其可能通過抗炎、免疫調節以及抗氧化損傷等作用對AIT 具有良好的療效[10]。因此，本研究選取雷公藤多苷片作為陽性對照藥，比較芹菜素對小鼠AIT模型的作用。

芹菜素是一種廣泛存在于各種水果和蔬菜、豆科植物以及茶葉中的黃酮類化合物，其具有良好的抗炎、抗氧化、免疫調節、抗癌、抗病毒等多種生物活性，本研究探討其對小鼠AIT模型的作用及機制。TGAb 和TPOAb 作為AIT 的兩種特征性自身抗體，是臨床診斷AIT 的重要指標之一[11]。本研究發現模型組血清TGAb 和TPOAb 水平較空白對照組明顯升高，甲狀腺損傷嚴重，可見大量炎癥細胞浸潤，血清TNF-α和IL-1β水平明顯升高，提示小鼠AIT模型構建成功。給予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠血清TGAb、TPOAb、TNF-α和IL-1β水平明顯降低，明顯改善甲狀腺組織炎癥細胞浸潤程度，呈現一定的劑量依賴性，其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優。SOD 和MDA 是現代研究機體氧化應激的重要指標之一。SOD 作為機體重要的抗氧化酶，對自由基具有消除作用，可防御機體的氧化損傷[12]。MDA 作為機體氧化損傷后產物，其水平與機體氧化損傷程度成正比[13]。本研究發現模型組的血清SOD 活性較空白對照組明顯降低，而MDA 含量明顯升高。給予雷公藤多苷片和芹菜素后血清SOD 活性明顯升高，MDA 含量明顯降低。其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優。Bcl-2 是機體內一種重要的凋亡抑制基因，能遏制多種有害因素導致細胞凋亡[14]。相反，Bax 是機體內一種重要的凋亡促進基因，可促進細胞的凋亡[15]。本研究發現模型組小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的表達水平較空白對照組明顯下調，而Bax 蛋白的表達水平顯著上調。給予雷公藤多苷片和芹菜素后，小鼠甲狀腺組織Bcl-2 蛋白的表達水平明顯上調，Bax 蛋白的表達水平顯著下調。其中以雷公藤多苷片組和芹菜素高劑量組效果最優。近年來，研究表明Notch1和ROR-γt除了參與誘導細胞凋亡的作用外，還參與調控機體炎癥反應，與自身免疫性疾病的發生發展密切相關[16]。本研究發現芹菜素和雷公藤多苷片可抑制小鼠甲狀腺組織Notch1 和ROR-γt 蛋白的表達水平，其中以芹菜素高劑量組和雷公藤多苷片組效果最優。提示芹菜素可能通過Notch1/RORγt信號通路改善自身免疫性疾病的凋亡和炎癥。

綜上所述，芹菜素可通過降低小鼠AIT 特征性自身抗體TGAb、TPOAb水平，減輕炎癥細胞浸潤程度和氧化應激損傷，以及抑制細胞凋亡，對AIT具有較好的保護作用。