HPLC法測定人血漿中頭孢噻肟鈉濃度及藥動學研究

張柏娥 ，戴偉鋒 ，付麗，3 ，趙高瓊 ，崔佳麗，楊宏博

（1.昆明理工大學，云南昆明 650504；2.云南省藥物研究所，云南昆明 650111；3.思維特健康管理有限公司，北京 100010）

頭孢噻肟鈉（cefotaxime Sodium，CTⅩ）是1977年德國制藥公司研發成功的首個第三代半合成頭孢菌素類抗生素，其抗菌譜廣，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、需氧菌和某些厭氧菌均有較好的抗菌活性，特別對革蘭陰性菌的殺滅作用更強，廣泛分布于全身各組織和體液中，臨床主要用于呼吸道感染、尿路感染、胃腸道及膽道感染和眼耳鼻喉感染等，對敗血癥、心內膜炎、腦膜炎、腹膜炎和皮膚軟組織感染等均有很好的療效[1-3]。自1998 年我國制藥公司仿制成功后，已經成為我國臨床用抗生素的主要品種[4]。但由于抗生素本身不良反應較多、長期不合理使用產生較強的耐藥性等原因，從而給人類的身體健康造成嚴重威脅[5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜系統Empower 色譜工作站（美國Waters 公司）；BP121S 電子天平（德國賽多利斯股份公司）；LN-9527-01 高速離心機（美國雅培公司）；ⅩW-80A 旋渦混合器（上海精科實業有限公司）。

1.2 材料

頭孢噻肟鈉（中國食品藥品檢定研究院，批號：CFTZ180063，質量分數：90.6%）；注射用頭孢噻肟鈉（哈藥集團制藥總廠，規格：0.5 g、1.0 g和2.0 g，批號：130220、130312 和130703）；頭孢拉定（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號：130427-201707，質量分數：95.7%）；乙腈（色譜純，美國Merck公司，批號：1428130）；乙酸、二氯甲烷、磷酸等試劑均為分析純；超純水利用實驗室超純水機自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 80? 柱（4.60 mm×250 mm，4 μm）；流動相：乙腈-20 mmol/L磷酸水溶液（體積比16∶84）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：234 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 標準溶液的配制

2.2.1 頭孢噻肟鈉標準溶液的配制 精密稱取頭孢噻肟鈉對照品55.20 mg 于25 mL 量瓶中，用超純水溶解后，定容至刻度，按含量折算后即得質量濃度2.000 mg/mL 的頭孢噻肟鈉儲備液，放置于冰箱中冷藏保存備用。試驗過程中依據需要，再將頭孢噻肟鈉儲備液稀釋成5.000、10.00、20.00、50.00、100.0、400.0、800.0、1 200、1 600 μg/mL的標準溶液。

2.2.2 頭孢拉定標準溶液的配制 精密稱取20.90 mg頭孢拉定對照品于25 mL容量瓶中，超純水溶解后，定容至刻度，按含量折算得質量濃度為800.0 μg/mL的內標儲備液，放置于冰箱中冷藏保存備用。

2.3 血漿樣品處理方法

精密吸取人含藥血漿200 μL，置于離心管中，加入800.0 μg/mL 頭孢拉定溶液20 μL，加入乙腈800 μL，振蕩混合均勻，10 000 r/min 離心5 min，上清液加0.3%乙酸溶液10 μL 調pH 值至酸性，加入二氯甲烷1 mL，振蕩混合充分，4 000 r/min離心3 min，精密吸取上清液10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄頭孢噻肟鈉峰面積與內標頭孢拉定峰面積。

2.4 方法學考察[12]

2.4.1 專屬性試驗 精密吸取不同來源空白混合血漿樣品200 μL，除不加內標溶液外，其他與“2.3”項方法操作，按“2.1”項色譜條件進樣，獲得色譜圖1A。

精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品180 μL，加入經儲備液稀釋的100.0 μg/mL 頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法操作，再按“2.1”項色譜條件進樣，獲色譜圖1B。

精密吸取1-01 受試者滴注頭孢噻肟鈉1 h 時收集的血漿樣品200 μL，按“2.3”項方法操作，按“2.1”項色譜條件進樣，獲得色譜圖1C。

對于天然餌料，不同的水庫，由于環境條件、水文情況等不相同，天然餌料的種群數量和產量也不一樣，有時差別還比較大。天然餌料不豐富的水庫，要通過設置人工魚巢、投放人工培育魚苗（如鯪魚），加大鯉、鯽魚的混養密度等措施，增加雜魚種群密度。

圖1 頭孢噻肟鈉高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms for CTⅩplasma samples

可見，血漿中頭孢噻肟鈉和頭孢拉定的保留時間分別約為5.9 min 和4.9 min，頭孢噻肟鈉峰和頭孢拉定峰分離度（約為2.5）大于1.5，且不受血漿中內源性物質的干擾，表明方法專屬性較好。

2.4.2 標準曲線和定量下限 取180 μL 不同來源人空白混合血漿樣品7份，每份分別依次精密吸取加入經儲備液稀釋的7個不同質量濃度的頭孢噻肟鈉標準溶液各20 μL，按“2.3”項方法進行操作，得質量濃度分別為0.500 0、1.000、5.000、10.00、40.00、80.00、160.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品和質量濃度為80.00 μg/mL 頭孢拉定血漿樣品。以上各濃度樣品平行操作，按“2.1”項色譜條件進行檢測，建立頭孢噻肟鈉的標準曲線。采用加權（W＝1/X2）最小二乘法，以頭孢噻肟鈉峰面積與內標峰面積比值（Ai）為縱坐標，以頭孢噻肟鈉質量濃度（C,μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸運算，求得線性回歸方程Ai＝0.026 9C-0.001，R2＝0.998 3。校正標樣回算的濃度均在標示值的±15%，最低定量下限（LLOQ）在±20%。由此可見，頭孢噻肟鈉人血漿樣品在0.500 0～160.0 μg/mL范圍內線性良好，LLOQ為0.500 0 μg/mL，符合體內生物樣品分析要求。

2.4.3 精密度和準確度試驗 取空白離心管，精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品各180 μL，再分別加入經儲備液稀釋的不同質量濃度的頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法進行操作，制成質量濃度分別為0.500 0、1.000、40.00、120.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品。每個質量濃度血漿樣品平行制備6 份，且在不同天連續制備3 個分析批次進行測定分析，測定頭孢噻肟鈉峰面積。結果表明，日內、日間精密度RSD 值均小于15%，符合生物樣品檢測要求，見表1。

表1 血漿中頭孢噻肟鈉批內、批間精密度和準確度Table 1 Within-run and between-run precision and accuracy of Cefotaxime Sodium in plasma

2.4.4 提取回收率試驗 精密吸取不同來源人空白混合血漿樣品各180 μL，再分別加入經標準溶液稀釋的不同質量濃度的頭孢噻肟鈉溶液20 μL，按“2.3”項方法進行操作，制備成質量濃度分別為低（1.000 μg/mL）、中（40.00 μg/mL）和高（120.0 μg/mL）頭孢噻肟鈉血漿樣品各6 份，測定頭孢噻肟鈉藥物峰面積和內標峰面積，并計算其比值，將比值帶入標準曲線方程計算實際質量濃度，按下面的公式計算提取回收率：提取回收率＝（測得的質量濃度/實際加入質量濃度）×100%。結果表明，頭孢噻肟鈉低、中、高質量濃度血漿樣品的提取回收率為90.88%～92.41%，符合生物樣品方法學考察要求，見表2。

表2 頭孢噻肟鈉血漿樣品提取回收率試驗結果Table 2 The recoveries of CTⅩplasma samples(n=6)

2.4.5 殘留效應 在最高定量限樣本與高濃度樣本測定后，隨之測定空白樣本，評估殘留。結果顯示，高濃度樣本檢測后，再測定分析空白樣本中的殘留不超過LLOQ 的20%，且同時不超過內標的5%，故認為本方法不存在殘留效應。

2.4.6 穩定性考察 精密配制質量濃度分別為1.000、40.00、120.0 μg/mL 的頭孢噻肟鈉血漿樣品，考察室溫（22±2）℃放置2 h、-80 ℃反復凍融3次和長期冷凍55 d 時頭孢噻肟鈉在血漿樣品中的穩定性，以及進樣前室溫（22±2）℃放置12 h 的樣品穩定性。結果表明，以上3 個質量濃度的頭孢噻肟鈉血漿樣品，在室溫放置2 h、-80 ℃反復凍融3 次、-80 ℃長期冷凍55 d 和在處理后室溫放置12 h 條件下均較穩定，見表3。

表3 頭孢噻肟鈉在人血漿中的穩定性考察結果Table 3 Stability of CTⅩin human plasma(n=6)

2.5 藥動學研究

2.5.1 志愿者選擇及血漿樣品的收集 本試驗方案經解放軍昆明總醫院批準后實施，共納入18名健康志愿者，年齡（24.25±2.49）a，體質量（58.52±8.83）kg，男女各半，無藥物過敏史、藥物依賴史和慢性疾病史，青霉素皮試陰性，試驗前7 d 內未服用任何藥品，半年內未參加過任何臨床試驗，實驗室檢查各指標合格，均簽署知情同意書，體檢各指標未出現具有臨床意義的異常，符合納排標準入組試驗。

受試者于試驗前一天晚10時開始禁食，試驗當日晨8 時空腹抽取空白血樣后隨機分為3 組，各組分別恒速靜脈滴注0.5、1.0、2.0 g 經0.9%NaCl 注射液制備的頭孢噻肟鈉注射液各100 mL，滴注30 min。從開始滴注計時，分別于0.08、0.25、0.50、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h 采靜脈血2 mL 至肝素管中，4 ℃保存，3 500 r/min 離心5 min，分離血漿，立即放于-80 ℃冰箱中保存備用。

2.5.2 血藥濃度測定 精密吸取上述滴注頭孢噻肟鈉受試者各時間點收集的血漿樣品200 μL，按“2.3”項方法進行平行操作后，利用上述經驗證的色譜條件平行測定各血漿樣品頭孢噻肟鈉濃度。

2.5.3 數據處理分析 采用DAS 2.0軟件對測定的不同時間點血藥濃度結果進行非房室模型（NCA）分析。

2.5.4 藥動學參數 通過數據處理分析，計算平均血藥濃度，建立平均血藥濃度-時間曲線（見圖2）。采用DAS2.0 軟件進行血藥濃度分析，獲得主要藥動學統計矩參數（見表4），并利用置信區間法[13]對各統計矩參數進行統計學分析。可見，隨給藥劑量增加，最大血藥濃度（Cmax）和濃度-時間曲線下面積（AUC0-t和AUC0-∞）值隨之增加；利用置信區間法分析表明，Cmax和AUC0-t在劑量0.5～2.0 g 范圍內β的90%置信區間分別為0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判斷區間0.70～1.43 和0.80～1.25 范圍內，表明頭孢噻肟鈉呈線性動力學特征。

表4 主要藥動學參數Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

表4 主要藥動學參數Table 4 The main pharmacokinetics parameters(,n=6)

圖2 單次靜脈滴注各劑量組頭孢噻肟鈉平均血藥濃度-時間曲線Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of different doses of CTⅩafter iv(,n=6)

3 討論

頭孢噻肟鈉因具有抗菌譜廣、治療效果好、毒副作用小等特點，在臨床應用廣泛，而對于其體內血藥濃度的監測及其藥動學研究國內外文獻報道相對較少。本研究建立了一種快速測定頭孢噻肟鈉血漿樣品濃度的HPLC法。為了減少系統誤差對測試樣品濃度的影響，在方法學研究過程中，對每批樣品分析時，將質控樣品（1.000、40.00、120.0 μg/mL）均勻分布在未知樣品測試順序中，建立隨行標準曲線，從而保證了檢測樣品的準確性。

本研究建立的HPLC 法，血漿中內源性物質不干擾樣品的測定，內標物頭孢拉定的保留時間約為4.9 min，頭孢噻肟鈉的保留時間約為5.9 min。與熊原等[6]和顧宜等[7]的報道比較，雖然樣品檢測時間大體相同，但樣品前處理比較簡便。另外，也有文獻報道采用內標法測定血漿中頭孢噻肟鈉濃度，可能由于選擇內標物的原因，使待測內標物（分別為咖啡因和3，5-甲苯二酚）檢測完成的保留時間分別為10.6 min和12.26 min[8-9]，樣品整體的檢測時間與本研究的相比，增加約1倍。本研究檢測更加快速的原因可能主要有兩個方面：首先，優化了血漿的處理方法，采用乙腈蛋白沉淀，0.3%乙酸溶液調pH，二氯甲烷除雜，由于選用的試劑及方法合理，測定時雜質峰干擾少、靈敏度高，操作也簡便；其次，內標物的選擇，無論本研究還是文獻[7，9]報道中，頭孢噻肟鈉的保留時間基本一致，文獻中內標物保留時間在頭孢噻肟鈉的保留時間之后，而本研究中選擇的內標物頭孢拉定在頭孢噻肟鈉保留時間之前，且內標物能與雜質峰可完全分離，大大縮短了每個樣品的檢測時間。

本研究采用建立的HPLC法測定了單次給予不同劑量（0.5、1.0和2.0 g）時、不同時間點的頭孢噻肟鈉血藥濃度，并對不同劑量/規格的藥動學參數進行統計分析，比較不同劑量間藥動學參數的差異性，結果表明隨著給藥劑量增加，Cmax、AUC0-t和AUC0-∞值增加，Cmax和AUC0-t在劑量0.5～2.0 g 范圍內β的90%置信區間分別為0.79～1.21和0.87～1.04，均落在Cmax和AUC0-t的判斷區間0.700～1.43 和0.80～1.25 范圍內，表明頭孢噻肟鈉3個劑量組Cmax和AUC0-t參數與劑量間具有線性相關，由此提示在臨床上靜脈注射頭孢噻肟鈉時，應考慮劑量對人體產生的影響。

本研究僅對單次給予不同劑量的頭孢噻肟鈉進行血藥濃度監測及藥動學分析，在今后的研究中，可考慮單用頭孢噻肟鈉連續給藥或與β-內酰胺酶抑制劑組成復方單次/連續給藥，綜合系統地考察頭孢噻肟鈉在人體內的藥動學特點。