蒲桃花提取物清除自由基活性研究

劉 茜

(梧州學院 化學工程與資源再利用學院，廣西 梧州 543002)

自由基是生命活動時所產生的一種帶有未成對電子的基團，在生命體的新陳代謝過程中，自由基對機能的平衡調節發揮著重要作用。但是，如果生命體內有過多的自由基，也會對生命體造成傷害，它會使蛋白質、核酸(DNA)變性等，也會加速生命體的衰老進程和各種疾病的產生[1-5]。為此，研發高效無毒、天然的自由基清除劑更符合大眾對綠色安全保健品的意愿。蒲桃，為桃金娘科植物，又名水蒲桃、水石榴，香果等，學名為Syzygiumjambos(L.)Alston，熱帶亞熱帶多年生的常綠喬木[6]。蒲桃的花期為3、4月，觀賞價值高，蒲桃的地上部分，除莖之外的其他部位均可入藥?！侗静菰傩隆分杏涊d蒲桃“味甘酸﹐性熱,無毒;入脾﹑肺二經;暖胃健脾。治肺虛寒嗽，破血積疽瘤?！逼烟抑泻袑ψ杂苫哂辛己们宄钚缘狞S酮類、多酚類等，這為蒲桃開發為天然無毒的抗氧化劑提供了物質基礎[7-9]。為此，本試驗采用乙酸乙酯、無水乙醇、蒸餾水3種不同極性溶劑對蒲桃花進行超聲提取，通過比較所得提取物對自由基的清除作用，分析不同極性溶劑對提取物清除自由基的影響，為深入研究蒲桃花活性成分的提取及其抗氧化活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及原料

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，上海金穗生物科技有限公司)；2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，上海金穗生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純。

SB-5200D超聲清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，752N紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市晶玻實驗儀器廠)，低溫冷卻液循環泵(鄭州長城科工貿有限公司)，旋轉蒸發器(上海申生科技有限公司)。

蒲桃花，采集于梧州學院旦沖蒲桃果園。

1.2 蒲桃花提取物的制備

采摘新鮮蒲桃花，經梧州學院植物學教師鑒定為桃金娘科屬的蒲桃〔Syzygiumjambos(L.)Alston〕花，60℃恒溫干燥8 h，粉碎。稱取3份10.0 g粉碎后的蒲桃花分別加入乙酸乙酯、無水乙醇、蒸餾水各150 mL，常溫下超聲輔助提取1 h，提取液抽濾，濾液經減壓濃縮至10 mL，濃縮液自然揮發剩余溶劑，分別得到提取物EAE、AAE和DWE。

1.3 蒲桃花提取物對DPPH·清除作用試驗

參考文獻，根據不同極性溶劑得到的提取物對DPPH·清除能力的不同，配制相應的蒲桃花提取物的系列質量濃度溶液，分別將各質量濃度溶液與DPPH·溶液混合暗處避光反應30 min，立刻測混合液在波長為517 nm下的吸光度，重復試驗3次[5,10-12]。根據試驗數據，以質量濃度為橫坐標、自由基清除率為縱坐標，擬合得 DPPH·清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關系曲線(圖1)。根據曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對DPPH·半抑制質量濃度IC50值(表1)，并與標準抗氧化劑BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)的IC50值對比。

圖1 蒲桃花提取物對DPPH·的清除作用 圖2 蒲桃花提取物對ABTS+·的清除作用

1.4 蒲桃花提取物對ABTS+·清除作用試驗

參考文獻，制備ABTS+·儲備溶液，同時根據不同極性溶劑得到的提取物對ABTS+·清除能力的不同，配制相應的蒲桃花提取物的系列質量濃度溶液，取ABTS+·儲備液1.9 mL與各濃度浸膏溶液0.1 mL在室溫暗處混合3 min，然后立刻測混合液在波長為734 nm下的吸光度，重復實驗3次[5,12]。根據試驗數據，以質量濃度為橫坐標、自由基清除率為縱坐標，擬合得ABTS+·自由基清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關系曲線(圖2)，根據曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對ABTS+·半抑制質量濃度IC50值(表1)，并與標準抗氧化劑BHT的IC50值對比。

1.5 蒲桃花提取物對·OH清除作用試驗

參考文獻，根據不同極性溶劑得到的提取物對·OH清除能力的不同，配制相應的蒲桃花提取物的系列質量濃度溶液，測定各質量濃度的蒲桃花提取物溶液與利用Fenton試劑產生的·OH作用后在波長為510 nm下的吸光度，重復實驗3次[5,13]，并根據Fenton法的計算公式計算其清除率，根據試驗數據，以質量濃度為橫坐標、自由基清除率為縱坐標，擬合得·OH清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關系曲線(圖3)，根據曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對·OH半抑制質量濃度IC50值(表1)，并與標準抗氧化劑BHT的IC50值對比。

圖3 蒲桃花提取物對·OH的清除作用

2 結果與討論

為保證試驗數據的準確，對同一批次采集到的蒲桃花進行提取物對自由基清除作用的測定時，每個濃度溶液平行測定3次，確保數值在相對誤差允許范圍內，排除偶然誤差對本試驗的干擾，最后取平均值，即為該濃度下水蒲桃花提取物對自由基的清除作用值。

衡量物質抗氧化能力的重要指標是對各類自由基如DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力。試驗中，常用物質清除50%自由基的質量濃度來衡量其清除自由基的活性。半抑制劑量IC50值越大，表明該物質清除自由基的活性越低，而當物質的IC50<10 mg/mL時，表明其與自由基相互作用強，有良好的自由基清除活性[5，13]。同時，與標準抗氧化劑BHT的IC50對比也能說明抗氧化劑的清除活性。

此外，探討溶劑效應對提取物活性成分不同的影響，再進一步探討活性成分不同而導致其與自由基的作用程度的不同，對于準確評估蒲桃花提取物的抗氧化活性具有一定的試驗意義，故我們在試驗中用3種不同極性溶劑對蒲桃花活性成分進行提取，并對比3種提取物對自由基作用情況。

2.1 蒲桃花提取物清除DPPH·的結果

DPPH·是一種藍紫色而相對較穩定的自由基，隨著自由基清除試劑的加入，DPPH·最大吸收波長的吸光度會相應地降低。因此，可通過其與自由基清除試劑相互作用后的吸光度變化來評價清除試劑的抗氧化能力。從表1和圖1中可知不同提取試劑得到的蒲桃花提取物EAE、AAE和DWE對DPPH·的清除效果，隨提取物質量濃度的增加清除率也在增大。與標準值10 mg/mL及標準抗氧化劑BHT的IC50值(14.50 mg/mL)[11]比較，3種不同極性溶劑得到的提取物對DPPH·的IC50值更小，分別為0.130，0.014，0.044 mg/mL，說明3種不同極性溶劑得到的提取物對DPPH·均有良好的清除活性，特別是無水乙醇和蒸餾水為溶劑所得的提取物的清除效果相當明顯，遠大于乙酸乙酯為提取溶劑的清除效果。提取物的清除活性順序為AAE > DWE>> EAE。對比這3種不同極性溶劑得到的提取物清除活性可知，以無水乙醇提取得到的提取物對DPPH·的清除能力最強，蒸餾水的次之，最差的是乙酸乙酯所得提取物。從溶劑極性來看，無水乙醇和蒸餾水的極性較大，乙酸乙酯極性較小，而AAE和DWE對DPPH·的清除能力明顯比EAE強，實驗數據說明極性大的溶劑所得提取物對DPPH·的清除活性更大。

2.2 蒲桃花提取物清除ABTS+·的結果

測量物質抗氧化活性的另一重要指標是對ABTS+·自由基的清除活性。根據表1和圖2中數據分析：蒲桃花提取物EAE,AAE和DWE對ABTS+·也表現出良好的清除活性，隨提取物濃度的增加，清除率也在增加，各提取物的IC50值分別為0.210，0.016，0.066 mg/mL，遠遠低于標準的抗氧化劑BHT的IC50值81.43 mg/mL[11]和衡量物質是否有清除活性的標準值10 mg/mL，各提取清除活性順序為AAE > DWE >EAE。從試驗數據可得：提取溶劑極性對提取物的ABTS+·的清除活性的影響與清除DPPH·的相似，極性大的無水乙醇和蒸餾水所得的提取物清除ABTS+·的活性更大。

2.3 蒲桃花提取物清除·OH的結果

依據表1和圖3的數據，在對·OH的清除活性試驗中，蒲桃花提取物對·OH同樣具有良好的清除活性，3種提取物對·OH的清除活性的IC50值分別為1.44，0.77，0.97 mg/mL，均低于標準值10 mg/mL。從試驗數據可知，提取物對·OH的清除活性依然受提取溶劑極性的影響，隨著溶劑極性的變小，浸膏對·OH清除的IC50值也在增大，清除活性變小，其對·OH的清除活性順序為AAE > DWE >EAE。

表1 蒲桃花提取物和BHT的IC50 mg/mL

3 結論

本試驗結果表明不同極性溶劑提取所得的蒲桃花中的活性物性對3種自由基作用結果有著一定的差別。本試驗中，對自由基表現出最好的清除活性是以無水乙醇為溶劑得到的蒲桃花提取物(AAE)，蒸餾水的(WAE)次之，乙酸乙酯為溶劑得到的桃花提取物(EAE)的自由基清除活性稍差。分析試驗數據可知：極性大的溶劑所得提取物清除3種自由基的活性相對大些，可初步推斷蒲桃花中的活性成分的極性稍大。這為今后蒲桃的綜合開發和利用提供了一定的理論基礎。