不同TNM分期膀胱癌患者外周血CTCs的表達及臨床意義

毛天賜，張偉，羅娟

1.空軍軍醫大學唐都醫院泌尿外科，陜西 西安 710038；2.西安市兒童醫院耳鼻喉科，陜西 西安 710038

當膀胱細胞喪失控制時就會形成膀胱癌，該病為泌尿科常見的惡性腫瘤，具有較高的患病率，居惡性腫瘤第9 位[1]。早期多數患者常出現肉眼可見的血尿，隨著病情的不斷發展，還會出現尿急、尿頻、尿痛等臨床癥狀[2]。該病具有復發性高、致死率高及惡化程度較高等特點，造成該病患者死亡的主要因素為癌轉移，早期淋巴結轉移較多，依據腫瘤分級，進行膀胱根治切除術后淋巴結陽性率為5%～10%[3-4]。早期膀胱癌5 年內的生存率約69%，患者一旦出現周圍淋巴結被入侵，5 年生存率隨之下降為35%，若發生遠處轉移，5 年內生存率可下降至5%，因此早期診斷并予以及時的治療是改善患者預后的重點所在[5-6]。循環腫瘤細胞(CTC)為入侵外周血的細胞，同時也是腫瘤發生遠處轉移的基本條件，因此檢測CTC 可為判斷患者是否出現遠處轉移、治療方案的選擇提供重要依據[7]。本文分析了不同腫瘤分期(TNM)膀胱癌患者外周血CTCs 的表達情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取空軍軍醫大學唐都醫院2018 年6 月至2020 年9 月接收的58 例膀胱癌患者作為研究對象。納入標準：(1)所有患者自主同意參與本研究；(2)患者均符合膀胱癌的診斷標準[8]；(3)抽血檢查前未接受化療、放療等治療措施；(4)依從性良好者。排除標準：(1)臨床資料缺失或不全者；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)肝腎功能障礙者；(4)尿路感染者。58 例中男性35 例，女性23 例；年齡43～72 歲，平均(63.54±4.67)歲，其中≤63 歲27 例，＞63 歲31 例。依據國際TNM 分期系統將患者進行劃分，T 分期：T1期13 例，T2期16 例，T3期19 例，T4期10 例；N 分期：N0期26 例，N1期17 例，N2期8 例，N3期7 例；M 分期：M0期48 例，M1期10 例；TNM 總分期包括Ⅰ期10 例，Ⅱ期16 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期14 例；分化程度較低者35 例，分化程度較高者23 例；出現脈管侵犯者41 例，未出現脈管侵犯者17 例；出現神經侵犯者38 例，未出現神經侵犯者20 例；腫瘤大小≤6 cm3者34 例，腫瘤大小＞6 cm3者24例。

1.2 方法

1.2.1 CTCs采集方法 采集患者外周血5～8 mL，棄去前2 mL血液(前2 mL血液可能混合上皮細胞，導致結果出現假陽性)，收集于ACD抗凝管內，將其上下輕微顛倒以混勻血液，血液標本的保存及運輸均置于0℃～4℃環境中。

1.2.2 血液樣品CTCs的染色及分離 (1)選用密度梯度離心法進行樣本處理。采用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)依照1∶1 的比例進行全血稀釋，將稀釋所得血液樣本緩慢置入含有20 mL 聚蔗糖(Ficoll)單核層細胞分離液的離心管中(刻度為50 mL)進行離心，時間約15 min。離心處理后棄去上層血漿，將所留樣品置入新離心管(刻度為50 mL)中，向離心管內添加PBS約20 mL，輕微搖晃混勻，4℃環境中進行離心，時間為10 min，離心后棄去上清液。(2)捕獲抗體(EpCAM)的孵育。將200 μL的PBS重懸細胞轉移至離心管中(刻度為1.5 mL)。添加1份EpCAM，在正常室溫環境中進行孵育，時間為1 h。孵育后再次加入800 μL的PBS進行混勻，離心5 min，棄去上清液，應用200 μL 的PBS 重懸細胞。(3)腫瘤細胞的分離。將孵育得到的細胞懸液置入芯片中予以細胞分離，流速以200 μL/h 為宜，時間為1 h，分離后拆開芯片，并將芯片放置于器皿內。(4)CTCs 的染色方法。在芯片表面鋪滿固定劑，并進行15 min 的處理后除去固定劑。加透膜劑，予以處理，時間為15 min。加一抗混合液，在4℃避光環境中進行過夜孵育。次日應用PBS 進行泡洗，在15 min內、7～8 mL 的PBS 里進行3 次。再加二抗混合液，室溫條件下進行避光孵育，約40 min，加染核試劑，時間為20 min。再次應用PBS 進行泡洗，方法與上述一致。觀察并計算CTC陽性細胞數。見圖1和圖2。

圖1 可疑腫瘤細胞(×200)

圖2 上皮來源細胞(×200)

1.3 觀察指標 (1)比較不同臨床病理特征(包括性別、病理類型、年齡、分化程度、腫瘤大小、TNM總分期、T分期、N分期、M分期、脈管侵犯及神經侵犯等)患者之間CTCs 陽性率的差異。(2)比較不同TNM 分期患者的CTCs計數。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0 統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組均數比較采用方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床病理特征患者的CTCs 陽性率比較 58 例患者中CTCs 陽性者共22 例。膀胱癌患者不同性別、病理類型、年齡、分化程度及腫瘤大小間的CTCs 陽性率比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)；TNM 總分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脈管侵犯及神經侵犯患者中的CTCs 陽性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及無脈管侵犯和神經侵犯者，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的CTCs陽性率比較[例(%)]

2.2 不同TNM分期患者CTCs計數比較 CTCs計數在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者中依次升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 不同TNM分期患者的CTCs計數比較(，個)

表2 不同TNM分期患者的CTCs計數比較(，個)

注：與Ⅰ期比較，aP＜0.05；與Ⅱ期比較，bP＜0.05；與Ⅲ期比較，cP＜0.05。

3 討論

膀胱癌為泌尿系三大惡性腫瘤之一，發病率及致死率均居泌尿系惡性腫瘤前列，該病患病率存在種族性、地域性、性別差異，可于任何年齡患病，好發于50～70 歲人群[9-10]。相關調查結果顯示，2018 年世界范圍內膀胱癌患者約為54.9 萬人，死亡人數約20 萬人[11]。多數患者通常表現為肉眼無痛性血尿，隨著腫瘤的持續性生長及不斷浸潤，可導致間斷性血尿發展為持續惡性血尿，患者于晚期可發生排尿不暢等情況，甚至出現上尿路梗阻及尿潴留情況[12]。該病發病因素較復雜，臨床難以確定具體的患病病因，其中基因因素與環境因素具有較為密切的聯系，基因因素包括癌基因激活因素，環境因素主要包括吸煙、慢性長期性炎癥、高危型化學物品等[13]。隨著醫療技術的不斷發展，發現膀胱癌與其他因素也存在密切的關系。

國內外對于外周血CTCs 在惡性腫瘤(如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等)中的研究及報道較多，目前有多項研究表明，腫瘤TNM分期情況CTCs之間有一定的相關性，有利于制定個性化治療方案及后期療效觀察，現普遍認為該病發生的前提之一為CTCs。孫建兵等[14]提出過關于腎癌的研究，該研究將99 例腎癌患者，依據性別、病灶部分、浸潤深度、年齡、分化程度、TNM分期及脈管癌栓進行劃分，探討與CTCs 之間的關系。有研究表明，TNM 分期與CTCs 之間具有較高的相關性。檢測膀胱癌患者外周血CTCs水平能有效判定患者血行轉移情況以及遠處轉移情況[15]，對患者預后及療效評定具有重大意義。CTCs為現階段膀胱癌特異性血清標志物，因惡性腫瘤細胞可入侵至周圍組織中，進入淋巴管及血液系統中，并轉運至遠端組織中，形成病灶，CTCs能反映出轉移的實時情況[16-17]。研究表明，Ⅲ期或Ⅳ期膀胱癌進行CTCs 檢測具有更大的臨床價值[18]。本研究對我院接收的58 例膀胱癌患者依據TNM 分期、年齡、病理類型(導管浸潤型、小葉浸潤型)、分化程度、脈管侵犯、神經侵犯、性別進行劃分，結果顯示膀胱癌患者不同性別、病理類型、年齡、分化程度及腫瘤大小間，CTCs 陽性率比較差異無統計學意義(P＞0.05)；患者TNM 總分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脈管侵犯及神經侵犯患者中CTCs陽性率明顯高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及無脈管侵犯和神經侵犯者，差異有統計學意義(P＜0.05)。這與葛海燕等[19]提出的研究結論具有同質性，本研究與其對比具有一定的優勢，因本研究增加了TNM 總分期患者檢測CTCs 計數對比，發現CTCs 計數隨著TNM 分期的升高而增加。

綜上所述，膀胱癌患者CTCs 表達與腫瘤分期存在密切的關系，腫瘤TNM 分期越高，CTCs 計數越高，表明CTCs 可作為膀胱癌患者臨床診斷的重要指標之一。