miR-128-3p信號軸介導(dǎo)AXIN1調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制帕金森海馬神經(jīng)元凋亡

張廣萍 任德帥 陳團(tuán)團(tuán) 姜巖 杜姝

【摘 要】目的：探討HIF-1α/miR-128-3p和AXIN1在海馬神經(jīng)元凋亡中的作用，旨在闡明缺氧誘導(dǎo)因子miR-128-3p軸在MPTP所致PD小鼠海馬神經(jīng)變性中的作用。方法：通過腹腔注射MPTP進(jìn)行PD小鼠模型的建立，利用RT-PCR技術(shù)、Western Bolt和TUNEL染色檢測小鼠海馬腦組織HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表達(dá)與凋亡。結(jié)果：AXIN1在PD小鼠模型中高表達(dá)，而HIF-1α呈低表達(dá)；HIF-1α/miR-128-3p過表達(dá)可以使Axin1下調(diào)，而Wnt/β-catenin蛋白表達(dá)升高。結(jié)論：HIF-1α/miR-128-3p軸上調(diào)可通過抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信號通路抑制MPTP損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

【關(guān)鍵詞】帕金森；miR-128-3p；AXIN1；Wnt/β-catenin；凋亡

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一種常見而復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，主要以靜止震顫、肌肉強(qiáng)直以及運動遲緩等為主，其發(fā)病與氧化應(yīng)激、氧氣葡萄糖供應(yīng)不足以及黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺神經(jīng)元進(jìn)行性丟失有關(guān)[1]。PD的病因尚未完全闡明，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位變性為主，尚有其他臨床特點，如進(jìn)行性核上性麻痹（PSP）、紋狀體黑質(zhì)變性（SND）、ShyDrager綜合征（SDS）及橄欖腦橋小腦萎縮（OPCA）等[2]。miRNAs可以通過調(diào)節(jié)PD小鼠模型中黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元來影響PD的進(jìn)展。本研究探討HIF-1α、miR-128-3p和AXIN1在海馬神經(jīng)元凋亡中的作用，旨在闡明缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α/microRNA-128-3p（miR-128-3p）軸在MPTP所致PD小鼠海馬神經(jīng)變性中的作用，為臨床上治療PD提供理論依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 構(gòu)建模型與轉(zhuǎn)染

取健康雄性C57BL/6小鼠腹腔注射稀釋后的MPTP溶液，按每千克30mg/次/天，連續(xù)進(jìn)行5d。如果出現(xiàn)倦怠、煩躁、震顫、運動遲緩等形態(tài)特征表明PD模型構(gòu)建成功。將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、PD模型組、HIF-1α/miR-128-3p組、AXIN1組，收集小鼠血清以及腦組織進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。

1.2 RT-PCR技術(shù)

采用TRIZOL試劑盒進(jìn)行提取組織或細(xì)胞總RNA，并檢測濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)置條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)。放入熒光定量PCR儀檢測，采用 2-ΔΔCt法計算HIF-1α/miR-128-3p、AXIN1表達(dá)水平。

1.3 TUNEL法

將獲取的小鼠腦組織經(jīng)過切片、脫蠟、水化、TBS洗滌室溫孵育等處理后，雙蒸水洗片，滴加TUNEL反應(yīng)液并保持在37℃下孵育90分鐘，室溫后洗滌，加正常山羊血清封閉20分鐘。去掉血清后加入轉(zhuǎn)化的POD溶液于37℃下留置30分鐘。TBS洗滌后加入顯色液，待陽性細(xì)胞核染成棕黃色時用雙蒸水沖洗，終止反應(yīng)，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 Western Bolt

按照說明書采用RIPA提取組織或細(xì)胞蛋白，裂解離心后用BCA試劑盒檢測樣本蛋白濃度。

2 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗，計量資料采用（χ±s）表示，進(jìn)行t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MPTP誘導(dǎo)下各指標(biāo)的表達(dá)情況

利用qRT-PCR和Western blot分別檢測小鼠腦組織中各指標(biāo)的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，相比于正常組AXIN1呈高表達(dá)，而HIF-1α、 miR-128-3p呈低表達(dá)（P<0.05）。

3.2 過表達(dá)的HIF-1α/miR-128-3p下調(diào)AXIN1激活Wnt/β-catenin信號通路利用TUNEL法檢測

與正常組相比PD組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05）；與PD組相比，注射過表達(dá)HIF-1α/miR-128-3p組小鼠腦組織神經(jīng)元凋亡率明顯下降，Wnt/β-catenin蛋白的表達(dá)顯著升高（P<0.05）。由此可知過表達(dá)的HIF-1α/miR-128-3p通過下調(diào)AXIN1激活Wnt/β-catenin信號通路從而調(diào)控PD引起的神經(jīng)元凋亡。

4 討論

迄今為止，隨著對PD研究的不斷深入，其病因傾向于與年齡老化、環(huán)境因素、家族遺傳性以及遺傳易感等綜合因素有關(guān)。年齡老化：PD多發(fā)生于中老年人群，通常40歲前發(fā)病的可能性較低，而隨著年齡的增長，黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元、酪氨酸氧化酶和多巴脫羧酶活力，紋狀體多巴胺遞質(zhì)水平隨年齡增長逐漸減少，PD的發(fā)病率會出現(xiàn)明顯的增長，而僅少部分的老年人患此病，表明生理性多巴胺能神經(jīng)元蛻變不足以致病，年齡老化只是促發(fā)因素之一，但仍然存在著密切的關(guān)系[3]。環(huán)境因素：據(jù)臨床流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，PD的患者分別存在一定的地區(qū)差異，因此人文在一些環(huán)境中，某種具有毒性的物質(zhì)會對大腦神經(jīng)元造成損傷，加重了PD的發(fā)病[4]。家族遺傳：醫(yī)學(xué)家們在長期的實踐中發(fā)現(xiàn)帕金森病似乎有家族聚集的傾向，有帕金森病患者的家族其親屬的發(fā)病率較正常人群高一些[5]。遺傳易患：近年在PD患者中曾發(fā)現(xiàn)a共同核素基因的Alα-53THr突變[6]。

microRNAs（miRNAs）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、功能和疾病的關(guān)鍵因子，某些miRNA，如miR-124和miR-128，在神經(jīng)元中高度表達(dá)，并且在腦膠質(zhì)瘤患者中被HIF-1α上調(diào)[7]。而HIF-1α作為調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，是PD進(jìn)展的重要標(biāo)志物，還可以通過促進(jìn)細(xì)胞存活信號，對某些神經(jīng)退行性變發(fā)揮治療作用[8]。而Wnt作為一個關(guān)鍵的信號級聯(lián)調(diào)節(jié)PD的幾個細(xì)胞過程，包括分化，神經(jīng)元存活，神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)[9]。β-catenin在人腦中表達(dá)，是Wnt信號通路的重要組成部分，參與PD的病理生理[10]。同時，AXIN1負(fù)性調(diào)節(jié)典型的Wnt信號通路，和Wnt/β-catenin信號通路之間的相互作用在細(xì)胞凋亡中起著中心調(diào)節(jié)作用，因此被認(rèn)為是參與PD發(fā)病的新基因之一[11，12]。與此同時，研究認(rèn)為AXIN1是miR-128的靶基因，有望成為PD的治療候選基因[13]。通過假設(shè)HIF-1α/miR-128-3p軸可能通過調(diào)節(jié)AXIN1和相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路對PD病理學(xué)產(chǎn)生影響[14]。

本研究表明，HIF-1α/miR-128-3p軸上調(diào)可通過抑制Axin1和激活Wnt/β-catenin信號通路抑制MPTP損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。HIF-1α具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能用于PD的治療，預(yù)測HIF-1α同樣可能干擾特發(fā)性PD的發(fā)病機(jī)制，并改善PD患者的臨床預(yù)后，HIF-1α/miR-128-3p的升高可能成為PD患者治療的新靶點[15]。AXIN1有望成為PD的治療候選基因，正在進(jìn)行的臨床前研究應(yīng)最終為這種方法在帕金森病的疾病改良治療中的臨床應(yīng)用開辟前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳雅婷.改良式無保護(hù)助產(chǎn)護(hù)理在促進(jìn)初產(chǎn)婦自然分娩中的應(yīng)用效果觀察 [J].實用婦科內(nèi)分泌電子雜志，2020，7（1）：122.

[2] 李璐璐.無保護(hù)助產(chǎn)護(hù)理在促進(jìn)初產(chǎn)婦自然分娩中的應(yīng)用效果探討[J].全科口腔醫(yī)學(xué)電子雜志，2019，6（27）：107，111.

[3] 黨雪艷，何谷，張寒，等.氣囊仿生助產(chǎn)護(hù)理在促進(jìn)初產(chǎn)婦自然分娩中的應(yīng)用價值[J].實用婦科內(nèi)分泌電子雜志，2019，6（24）：151-152.

[4] 房國梁，趙杰修，張漓，等.有氧運動對大鼠大腦皮質(zhì)喝海馬組織Wnt/β-catenin信號通路的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2017，36（9）：765-772.

[5] 崔新新.缺氧誘導(dǎo)因子-1在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科雜志，2015，42（3）：294-298.

[6] 程麗萍，王浩，車峰遠(yuǎn)，等.α-突觸核蛋白通過抑制 Wnt /β-catenin信號通路參與帕金森病發(fā)病機(jī)制[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2019，36（1）：10-14.

[7] Cz A，Yh A，Ys B，et al.Quercetin suppresses the tumorigenesis of oral squamous cell carcinoma by regulating microRNA-22/WNT1/β-catenin axis-ScienceDirect[J].Journal of Pharmacological Sciences，2019，140（2）：128-136.

[8] 黃笑塵，楊煜，王保華，等.帕金森疾病與Wnt/β-catenin信號通路及氧化應(yīng)激作用的研究進(jìn)展[J].中國實驗診斷學(xué)，2020，24（8）：1373-1376.

[9] Wu X，Li S，Peng X，et al.Liraglutide Inhibits the Apoptosis of MC3T3-E1 Cells Induced by Serum Deprivation through cAMP/PKA/β-Catenin and PI3K/AKT/GSK3β Signaling Pathways[J].Moleculer Cells，2018，41（3）：234-243.

[10] 楊艷，楊愛明，孫俊，等.藏花素通過PI3K/Akt信號途徑對阿爾茨海默病細(xì)胞模型海馬神經(jīng)元凋亡及P-CREB表達(dá)水平的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2020，18（23）：55-59.

[11] Feng F，Chen A，Huang J，et al.Long noncoding RNA SNHG16 contributes to the development of bladder cancer via regulating miR-98/STAT3/Wnt/β-catenin pathway axis[J].J Cell Biochem，2018，119（11）：9408-9418.

[12] 張瓊，葉麗麗.過表達(dá)Mfn2基因通過PI3K/AKT通路抑制魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型的細(xì)胞凋亡[J].卒中與神經(jīng)疾病，2020，27（4）：435-439，443.

[13] Gao F，Jia L，Han J，et al.Circ-ZNF124 downregulation inhibits non-small cell lung cancer progression partly by inactivating the Wnt/β-catenin signaling pathway via mediating the miR-498/YES1 axis[J]. Anticancer Drugs，2021，32（3）：257-268.

[14] 蔡媧，馬文，王觀濤，等.基于Shh-Gli1信號通路探討電針對中風(fēng)后抑郁大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（9）：396-400.

[15] 胡聃，滕龍，洪芳，等.復(fù)方地黃顆粒對陰虛動風(fēng)證帕金森病大鼠紋狀體細(xì)胞凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2019，283（3）：20-25.

基金項目：《miR-128-3p信號軸介導(dǎo)AXIN1調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制帕金森海馬神經(jīng)元凋亡》（CSFGG-2020005）。