基于TLR4通路依托咪酯對感染性休克大鼠急性肺損傷的保護作用研究

王清兵路 超于 剛

(1.濱州市中心醫院麻醉科,山東 濱州 251700;2.濱州市中心醫院產房,山東 濱州 251700)

感染性休克是晚期膿毒血癥的一種嚴重并發癥,感染性休克常伴發急性肺損傷,機體出現急性、進行性低氧呼吸功能障礙,若不及時干預可引發多器官功能衰竭,死亡率極高[1]。因此,研究感染性休克導致急性肺損傷的機制并給予及時有效干預,對疾病預后有重要意義。炎癥反應是感染性休克發生發展的基礎,炎性介質如革蘭氏陰性細菌外膜脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)過度釋放,引起促炎因子過度釋放,從而引發炎癥級聯反應及一系列病理生理反應[2]。依托咪酯(etomidate,Eto)是臨床常用短效麻醉藥,研究顯示,Eto可抑制腎上腺皮質功能,從而調控機體炎癥反應,降低患者體內促炎因子水平,但具體調控機制尚不明確[3-4]。Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)是LPS受體,與免疫炎癥反應關系密切[5-6]。因此,本研究采用盲腸結扎穿孔法建立感染性休克大鼠模型,觀察Eto抑制感染性休克大鼠炎癥反應的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠,75只,7周齡,均為雄性,體重250～300 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養于齊魯動物保健品有限公司,使用許可證號[SYXK(魯)2019-0020],獲得濱州市中心醫院倫理審批(IACUC-20190210012),研究過程中做到了3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

Eto(江蘇恩華藥業股份有限公司,國藥準字H20020511);LPS(北京索萊寶科技有限公司);大鼠內毒素(endotoxin,ET)ELISA試劑盒(上海穎心實驗室設備有限公司);白介素(interleukin)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA試劑盒(上海邦奕生物);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物);兔抗大鼠TLR2、髓樣細胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核轉錄因子κB p65(nuclear factor κB p65,NF-κB p65)多抗(一抗,美國Abcam公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG單抗(二抗,北京索萊寶科技有限公司);徠卡切片機(德國徠卡,RM2016);實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司,7500);化學發光成像分析系統(美國Bio-rad公司,CheniDoc XRS)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組和模型制備

75只大鼠隨機分為假手術組、模型組、模型-LPS組、模型-Eto組、模型-Eto-LPS組,各15只。除假手術組外,其余各組依據參考文獻[7]采用盲腸結扎穿孔法復制感染性休克大鼠模型:以1.0 g/kg體重20%烏拉坦腹腔注射麻醉所有大鼠,監測頸內動脈平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP),左側股靜脈置入套管針,腹中線作2 cm切口,游離暴露盲腸,用3-0絲線環形結扎末端盲腸,用20 G針穿透末端盲腸壁2處(距離約3 mm),保證糞便持續流出,還納腸管后逐層閉合腹腔。監測MAP,低于基礎值70%時認為感染性休克建模成功。假手術組僅作剖腹手術,不結扎盲腸和穿孔,其余操作相同。

1.3.2 干預方法

手術前30 min,模型-LPS組腹腔注射LPS 15 mg/kg,模型-Eto組腹腔注射依托咪酯60 mg/kg(首次10 mg/kg,待大鼠有體動反應后每次追加10 mg/kg至給藥完畢),模型-Eto-LPS組同時腹腔注射依托咪酯60 mg/kg+LPS 15 mg/kg,模型組和假手術組腹腔注射生理鹽水。

1.3.3 標本采集

預實驗顯示盲腸結扎穿孔法復制感染性休克模型出現休克的時間為術后4.5～5.0 h,故以術后5 h為取材時間點。眼眶靜脈叢取血1.0 mL,3000 r/min離心10 min(離心半徑12 cm),收集上層血清,-20℃保存備用。處死各組大鼠,于氣管環切后插入氣管套管,用1 mL PBS反復灌洗,獲得肺泡灌洗液(alveolar lavage fluid,BALF),-20℃保存備用。收集BALF后打開胸腔,取右肺組織,固定于10%中性甲醛備用,另取部分右肺組織置于-80℃保存備用。

1.3.4 血清ET含量及BALF中炎癥因子水平檢測

取血清和BALF樣本,分別采用大鼠ET、IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒檢測血清ET含量及BALF中炎癥因子水平,按照試劑盒說明書操作,于酶標儀上檢測吸光度值(A570),吸光度-濃度曲線得出數據。

1.3.5 肺組織病理學觀察

取固定好的肺組織,常規制作石蠟切片,進行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,觀察肺組織病理學改變。

1.3.6 肺組織TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表達量檢測

取-80℃保存的肺組織,提取總RNA后進行逆轉錄,得到cDNA并調整其濃度,進行實時熒光定量PCR反應,擴增條件:95℃,60 s;95℃,15 s;60℃,20 s;72℃,45 s;共40循環,72℃再延伸5 min,以βactin為管家基因,2-ΔΔCT計算TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA的相對表達強度。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.7 肺組織TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達量檢測

將-80℃保存的肺組織研磨,用細胞裂解液裂解20 min,取裂解上清液,進行蛋白定量,取待測蛋白,進行SDS-PAGE電泳,經電轉、封閉后,加入1∶1000一抗,4℃過夜,TBST洗滌,加入1∶5000二抗,室溫2 h,暗室中曝光顯影,凝膠成像系統掃描拍照并進行灰度值分析(內參對照為β-actin)。

1.4 統計學方法

用SPSS 21.0分析數據,計量資料均以平均數±標準差(±s)表示,采用單因素方差分析多樣本組間資料,兩樣本比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況

除模型組1只、模型-LPS組2只大鼠術后未蘇醒建模失敗外,其余均建模成功,途中無脫落。假手術組大鼠術后活動及對外界刺激反應均正常;模型組及模型-LPS組術后出現呼吸頻率加快、喜臥、寒戰、對外界刺激反應差等情況,且模型-LPS組更為嚴重,出現拒絕飲食進水、呼吸窘迫等情況;模型-Eto組上述癥狀較模型組減輕,模型-Eto-LPS組較模型-Eto組嚴重。

2.2 各組大鼠ET含量比較

大鼠ET含量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05);模型組、模型-LPS組、模型-Eto組、模型-Eto-LPS組ET含量均高于假手術組,其中模型-Eto組＜模型-Eto-LPS組＜模型組＜模型-LPS組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 ET含量比較Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with model-LPS group,cP＜0.05.Compared with model-Eto group,dP＜0.05.Figure 1 Comparison of ET content

2.3 各組大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05);與假手術組比較,模型組、模型-LPS組、模型-Eto組、模型-Eto-LPS組BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較高,其中模型-Eto組＜模型-Eto-LPS組＜模型組＜模型-LPS組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(ˉ±s)Table 2 Comparison of IL-1 β,IL-6 and TNF-α levels in BALF

表2 BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(ˉ±s)Table 2 Comparison of IL-1 β,IL-6 and TNF-α levels in BALF

注:與假手術組相比,aP＜0.05;與模型組相比,bP＜0.05;與模型-LPS組比,cP＜0.05;與模型-Eto組比,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with model-LPS group,cP＜0.05.Compared with model-Eto group,dP＜0.05.

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2.4 各組肺組織病理學觀察

HE染色顯示,假手術組肺組織結構基本正常;模型組和模型-LPS組肺組織出現急性損傷,肺泡明顯充血,肺泡壁、肺間質增厚,大量中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤,且模型-LPS組病變更為嚴重;模型-Eto組和模型-Eto-LPS組肺組織的上述病變均減輕,但偶有肺泡毛細血管充血和炎性細胞浸潤,且模型-Eto組減輕更為明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織HE染色圖片Figure 2 HE staining pictures of lung tissue in each group

2.5 各組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較

大鼠肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P＜0.05);與假手術組比較,模型組、模型-LPS組、模型-Eto組、模型-Eto-LPS組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達量均較高,其中模型-Eto組＜模型-Eto-LPS組＜模型組＜模型-LPS組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較(±s)Table 3 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 mRNA expression in lung tissue

表3 肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較(±s)Table 3 Comparison of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 mRNA expression in lung tissue

注:與假手術組相比,aP＜0.05;與模型組相比,bP＜0.05;與模型-LPS組相比,cP＜0.05;與模型-Eto組相比,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with model-LPS group,cP＜0.05.Compared with model-Eto group,dP＜0.05.

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2.6 各組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量比較

各組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65表達量比較,差異有統計學意義(P＜0.05);與假手術組比較,模型組、模型-LPS組、模型-Eto組、模型-Eto-LPS組肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量均較高,其中模型-Eto組＜模型-Eto-LPS組＜模型組＜模型-LPS組,差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖3。

圖3 肺組織中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量比較Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with model-LPS group,cP＜0.05.Compared with model-Eto group,dP＜0.05.Figure 3 Comparison of relative expressions of TLR4,MyD88 and NF-κB p65 in lung tissue

3 討論

感染性休克發病機制十分復雜,由其導致的急性肺損傷已成為感染性休克患者死亡的主要原因[8-9]。嚴重感染尤其是革蘭氏陰性細菌感染可釋放LPS、肽糖酐等毒性代謝物,從而激活機體體液和細胞免疫反應系統,促進TNF-α、IL-1β等多種促炎因子釋放[10]。研究顯示,炎性介質和細胞因子可增加毛細血管通透性、促進血小板凝集等作用,從而對血管造成嚴重損傷,且此種損傷不依賴初始觸發因素,一旦啟動可不斷放大,最終導致肺毛細血管膜通透性增加,引起急性肺損傷[11-12]。盲腸結扎穿孔具有完全模擬感染性休克發生發展的病理過程的優勢,同時可給模型動物足夠反應時間,是感染性休克常用的動物模型復制方法。本研究應用盲腸結扎穿孔法復制感染性休克大鼠模型,觀察Eto干預對急性肺損傷的保護作用及調控機制,為臨床治療提供參考。

Eto屬于咪唑類衍生物,具有起效快、副作用少等優點,在麻醉誘導和維持中具有較高應用價值[13]。既往研究顯示,Eto可抑制機體腺皮質功能,從而抑制促炎因子釋放,調節細胞因子平衡[14-15]。另有研究表明,Eto可通過抑制血漿皮質醇的分泌,從而降低機體應激反應,抑制急性炎癥反應,且抑制作用可持續至停藥后24 h[16]。本研究復制感染性休克大鼠模型后,模型組大鼠BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高,說明大鼠肺已出現急性炎癥反應,模型-Eto組大鼠ET含量及BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低,肺組織病變減輕,提示Eto可抑制內毒素及促炎因子釋放,對感染性休克大鼠急性肺損傷具有保護作用。

TLR4是TLRs家族重要成員之一,是機體固有免疫系統重要組成部分[17]。MyD88是TLR4下游重要信號分子,TLR4識別病原而活化,與MyD88結合并使其活化,從而激活下游NF-κB,促進炎癥相關基因轉錄和翻譯,IL-1β、IL-6、TNF-α大量合成和分泌,引起炎癥級聯反應[18-20]。因此,若可靶向抑制TLR4水平則可有效阻斷炎癥級聯反應。既往研究顯示,Eto可通過調節TLR4信號通路抑制內毒素所致小鼠急性肺損傷的炎癥反應,說明Eto可靶向抑制TLR4炎癥級聯反應[21]。本研究復制感染性休克大鼠模型后,模型組大鼠TLR4、MyD88、NF-κB表達均上調,TLR4通路激活;模型-Eto組TLR4、MyD88、NF-κB表達下調,說明Eto可抑制TLR4通路;在Eto干預基礎上給予TLR4激活劑LPS干預,模型-Eto-LPS組TLR4、MyD88、NF-κB表達較模型-Eto組上調,且ET含量及BALF中IL-1β、IL-6、TNFα水平較模型-Eto組升高,進一步說明Eto是通過TLR4通路抑制感染性休克大鼠急性炎癥反應,發揮對急性肺損傷的保護作用。

綜上所述,Eto對感染性休克大鼠急性肺損傷具有保護作用,可能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路發揮調控作用,為臨床感染性休克所致急性肺損傷的防治提供參考依據。在進一步的研究中,應繼續開展大樣本動物實驗驗證本研究的結果,且需深入剖析Eto對急性肺損傷的保護機制,為臨床提供更多參考依據。