普魯卡因通過ERK/MAPK/FAK通路抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲

秦文英陳麗華高方方

(河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)麻醉與圍術期醫學科,河南 洛陽 471002)

骨肉瘤是常見的原發性骨惡性腫瘤,好發于兒童和青少年,易引起嚴重并發癥,導致殘疾,嚴重威脅人類的生命健康[1]。骨肉瘤發病率較高,僅次于腦腫瘤和淋巴瘤,具有惡性程度高、易發生轉移的特點,其復發或發生轉移會影響預后,降低患者5年生存率[2-3]。目前,甲氨蝶呤、多柔比星、順鉑等常用臨床化療藥物在骨肉瘤化療中出現的耐藥性及毒副作用逐漸成為制約其發展的主要問題,而靶向治療等治療骨肉瘤的新方法尚處于起步階段,其有效性及安全性還需大量臨床資料證實[4]。因此,尋找一種安全、有效的藥物來延緩骨肉瘤進展具有重要價值。普魯卡因是一種脂溶性局部麻醉藥物,已廣泛應用于臨床麻醉中,近年研究發現,普魯卡因在腫瘤治療領域也有一定作用,目前在肺癌、肝癌、胃癌等癌癥中已有初步研究[5]。細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶/黏著斑激酶(extracellular signal regulated kinase/mitogen activated protein kinase/focal adhesion kinase,ERK/MAPK/FAK)通路與多種癌細胞遷移及侵襲密切相關[6-8]。本研究通過研究普魯卡因對骨肉瘤細胞增殖、遷移及侵襲行為的影響,并探討可能存在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

人骨肉瘤細胞Saos-2(貨號:QY-x646)購自美國ATCC細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

普魯卡因、蛋白提取試劑盒(貨號:IP0390-1、BC3640)購自Solarbio;Y15(貨號:T7119)購自美國TargetMol;DMEM培養基(貨號:KL-P0032)購自德國sigma;CCK-8(貨號:CK-04)購自日本同仁;AnnexinV-FITC/PI試劑盒(貨號:S0185)購于哈爾濱新海基因檢測有限公司;Matrigel基質膠(貨號:356234)購自美國BD;結晶紫染液、BCA蛋白測定試劑盒、化學發光試劑盒(貨號:E607309-0100、C503021-0500、D601039-0050)購自生工生物工程有限公司;p-ERK抗體、ERK抗體、p-p38 MAPK抗體、p38 MAPK抗體、p-FAK抗體、FAK抗體、GAPDH抗體(貨 號:ab223500、ab17942、ab4822、ab31828、ab4792、ab40794、ab181602)購自英國abcam;羊抗兔IgG二抗(貨號:0295 G-HRP)購自美國santa;MIR-262-PC培養箱購于日本松下;MODEL550酶標儀及ChemiDocXRS化學發光成像系統購自美國Bio-Rad;BD FACSCanto II流式細胞儀購于美國BD;CX31顯微鏡購自日本Olympus。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與分組

人骨肉瘤Saos-2細胞用DMEM培養基,置于培養箱(37℃、5% CO2)內培養,融合75%后,消化、傳代培養。

取處于對數生長期的Saos-2細胞,每毫升接種1×105個于96孔培養板,每孔加100 μL,分為對照組、普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組,對照組為不含藥物的完全培養液,普魯卡因組加終濃度為2 μmol/L的普魯卡因,Y15組加入終濃度為10 μmol/L的Y15,普魯卡因+Y15組加入終濃度為2 μmol/L的普魯卡因及終濃度為10 μmol/L的Y15[9]。

1.3.2 CCK-8法檢測各組Saos-2細胞增殖情況

將Saos-2細胞按照1.3.1分組處理后分別培養24、48和72 h,加CCK-8,培養2 h,酶標儀(450 nm)檢測吸光度(OD)值。藥物處理組按下列公式計算細胞存活率(%)=OD藥物處理組/OD對照組×100%

1.3.3 流式細胞儀測定各組Saos-2細胞凋亡情況

Saos-2細胞按照1.3.1分組處理,培養48 h,細胞收集、消化、洗滌,使用結合緩沖液調整為每毫升1×106個的細胞懸液,按照相應試劑盒說明書步驟,依次加入Annexin V-FITC、PI各5 μL,黑暗處孵育1 h,流式細胞儀測定Saos-2細胞的凋亡率。

1.3.4 Transwell法檢測各組Saos-2細胞遷移情況

用無血清培養液將1.3.1中各組Saos-2細胞稀釋為每毫升2.0×105個細胞的懸液,向Transwell小室上室加200 μL,下室加10%胎牛血清的培養液500 μL,在37℃、5% CO2培養箱中孵育24 h,擦去未穿膜細胞,用4%多聚甲醛10 min,PBS洗滌,0.5%結晶紫染液染色20 min,PBS洗滌。倒置在200倍鏡的顯微鏡下,隨機選取6個視野,觀察并拍照,統計遷移細胞數,計算平均值。

1.3.5 Transwell法檢測各組Saos-2細胞侵襲情況

用無血清培養基以1∶8的比例稀釋Matrigel基質膠,向Transwell小室上室中加50 μL,37℃過夜凝固,后續操作按照1.3.4中細胞遷移情況檢測步驟進行操作,隨機選6個視野,統計侵襲細胞數,計算其平均值。

1.3.6 蛋白印跡(Western blot)法檢測各組Saos-2細胞中ERK/MAPK/FAK通路相關蛋白表達情況

將Saos-2細胞按照1.3.1分組處理,培養48 h,細胞收集、提取總蛋白、定量。電泳分離蛋白并轉至PDVF膜,含5%脫脂奶粉的TBST進行封閉1,分別加入p-ERK抗體(1∶500)、ERK抗體(1∶500)、p-p38 MAPK抗體(1∶500)、p38 MAPK抗體(1∶500)、p-FAK抗體(1∶500)、FAK抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶500),4℃過夜,洗滌,加羊抗兔IgG二抗(1∶5000),常溫孵育1 h,發光法顯色后拍攝圖像,分析條帶的灰度值。

1.4 統計學方法

使用SPSS 24.0統計學軟件處理數據。符合正態分布的計量資料用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較進行單因素方差分析,兩兩比較進行SNKq檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Saos-2細胞增殖情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細胞存活率均顯著降低(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞存活率均顯著降低(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞存活率的差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組Saos-2細胞存活率比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

表1 各組Saos-2細胞存活率比較(±s,n=6)Table 1 Comparison of Saos-2 cell survival rates in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.2 各組Saos-2細胞凋亡情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞凋亡率均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞凋亡率的差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組Saos-2細胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis of Saos-2 cell in each group

表2 各組Saos-2細胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

表2 各組Saos-2細胞凋亡率比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of Saos-2 cell apoptosis rates in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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2.3 各組Saos-2細胞遷移情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細胞遷移細胞數均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞遷移細胞數均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞遷移細胞數的差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2、表3。

表3 各組Saos-2細胞遷移細胞數比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

表3 各組Saos-2細胞遷移細胞數比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of Saos-2 cell migration numbers in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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圖2 各組Saos-2細胞遷移情況Figure 2 Migration of Saos-2 cell in each group

2.4 各組Saos-2細胞侵襲情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細胞侵襲細胞數均顯著升高(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞侵襲細胞數均顯著升高(P＜0.05)。與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞侵襲細胞數的差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖3、表4。

表4 各組Saos-2細胞侵襲細胞數比較(xˉ±s,n=6)Table 4 Comparison of Saos-2 cell invasion numbers in each group

圖3 各組Saos-2細胞侵襲情況Figure 3 Invasion of Saos-2 cell in each group

2.5 各組Saos-2細胞中ERK/MAPK/FAK通路相關蛋白表達情況

與對照組相比,普魯卡因組、Y15組、普魯卡因+Y15組Saos-2細胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05);與普魯卡因組相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細 胞 中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05);與Y15相比,普魯卡因+Y15組Saos-2細胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK蛋白表達水平的差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖4、表5。

表5 各組Saos-2細胞中ERK/MAPK/FAK通路相關蛋白表達情況比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

表5 各組Saos-2細胞中ERK/MAPK/FAK通路相關蛋白表達情況比較(±s,n=6)Table 5 Comparison of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

注:與對照組相比,*P＜0.05;與普魯卡因組相比,#P＜0.05;與Y15組相比,$P＜0.05。Note.Compared with the control group,*P＜0.05.Compared with the procaine group,#P＜0.05.Compared with the Y15 group,$P＜0.05.

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圖4 Western blot檢測各組Saos-2細胞中ERK/MAPK/FAK通路相關蛋白表達情況Figure 4 Western blot analysis of ERK/MAPK/FAK pathway-related protein expression of Saos-2 cell in each group

3 討論

骨肉瘤起源于骨間葉細胞,是常見的原發性惡性腫瘤,含有大量未成熟的骨或骨樣組織,惡性程度高且易發生轉移[10]。目前通常采用手術切除轉移灶、放化療及分子靶向療法等對骨肉瘤進行治療,都具有一定治療效果。然而,這些治療手段仍存在一定缺陷,例如,手術療法容易產生較大創傷,放化療法的敏感性相對不高,且化療具有明顯的不良反應,明顯降低了患者的生存質量,而分子靶向療法的治療費用相對較昂貴,易對患者造成巨大的經濟負擔[11-13]。臨床研究表明,骨肉瘤的高轉移率和高復發率是骨肉瘤治療的主要問題[14-15]。因此,探索能夠干預骨肉瘤發生發展的新治療手段迫在眉睫,一些高效、安全、便宜的可能用于骨肉瘤治療的藥物逐漸引起了人們的關注。

普魯卡因是一種局部麻醉藥物,在臨床麻醉中,具有麻醉效果好、藥物毒性低等優點。近年研究發現,普魯卡因可以對腫瘤細胞進行DNA去甲基化,可以增加幾種常用抗癌藥物的抗腫瘤活性,對放射治療具有增敏作用[5]。然而,普魯卡因在骨肉瘤中的研究尚不完善。Ying等[16]研究發現,普魯卡因能夠通過上調microRNA-133b表達抑制骨肉瘤細胞增殖和遷移,并促進細胞凋亡。本研究結果顯示,普魯卡因組Saos-2細胞存活率、遷移細胞數、侵襲細胞數較對照組均顯著降低,細胞凋亡率較對照組均顯著升高,表明普魯卡因對Saos-2細胞增殖、遷移、侵襲均具有明顯的抑制作用。

ERK/MAPK/FAK通路是腫瘤發生遷移、侵襲的常見信號通路,在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用,其中ERK、p38 MAPK、FAK是這一通路的重要成員,激活后可產生、分泌多種細胞因子,通過抑制腫瘤抑制因子活化,在腫瘤形成的任何時期均可發揮促進惡性腫瘤細胞存活及轉移的作用[9]。蘇小桃等[17]研究表明,二甲雙胍可抑制骨肉瘤MG63細胞的遷移和侵襲能力,可能是通過下調埃茲蛋白和MAPK/Erk信號通路而實現。曹飛等[18]研究表明,賴氨酸羥化酶2促進骨肉瘤遷移和侵襲的機制可能與激活FAK/JAK2-STAT3信號通路有關。Yang等[19]研究發現,FAK可能通過促進上皮-間質轉化相關轉錄因子表達促進腫瘤的侵襲和轉移。既往研究發現,化療的輔助藥物普魯卡因,對脂多糖誘導的結腸癌細胞遷移、侵襲具有抑制作用[20]。本研究結果顯示,普魯卡因組Saos-2細胞中p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-FAK/FAK

蛋白表達水平較對照組均顯著降低,表明在骨肉瘤細胞中普魯卡因可影響ERK、p38 MAPK、FAK的磷酸化過程。Y15是ERK/MAPK/FAK通路抑制劑,可通過抑制FAK磷酸化,進而影響ERK、p38 MAPK的磷酸化過程。本研究使用Y15處理Saos-2細胞,發現Saos-2細胞存活率、遷移細胞數、侵襲細胞數均顯著降低,表明ERK/MAPK/FAK通路確實是Saos-2細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的關鍵通路。在使用Y15處理基礎上,在使用普魯卡因處理Saos-2細胞,發現Saos-2細胞的存活率、遷移細胞數、侵襲細胞數較單獨使用Y15處理無顯著變化,推測普魯卡因對Saos-2細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲過程的影響可能是通過抑制ERK/MAPK/FAK通路激活發揮作用的。

綜上所述,普魯卡因可能通過抑制ERK/MAPK/FAK通路激活抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲,這為普魯卡因用于臨床治療骨肉瘤患者奠定了理論基礎。但體外環境不能完全代表體內環境,普魯卡因的抗骨肉瘤增殖、遷移、侵襲作用在動物體內是否效果依舊還需進一步設計動物實驗驗證。