雄激素對老年大鼠胃粘膜線粒體功能的影響及機制

郭朋璐董 曼嚴曉紅康 潔

(1.哈勵遜國際和平醫院,消化內科內鏡室,河北 衡水 053000;2.河北省以嶺醫院,石家莊 050000)

氧化應激增加和抗氧化功能降低被認為是胃損傷的關鍵因素[1-2]。線粒體是衰老過程中細胞生存和死亡的關鍵調節因子,與年齡相關的結構和功能改變已在人類胃腸道中得到證實[3]。隨著年齡的增長,老年大鼠的腺體萎縮被過度產生活性氧的結締組織所取代,并且Caspase-3凋亡蛋白的表達增加[4]。研究表明雄激素具有抗氧化作用,雄激素缺乏與心血管氧化應激密切相關[5]。雄激素水平影響去勢大鼠黑質的氧化應激[6]。目前,尚不清楚雄激素在胃粘膜線粒體介導的細胞凋亡中的作用。因此,本研究旨在探討雄激素對睪丸切除(gonadectomized,GDX)雄性老年大鼠胃黏膜細胞凋亡的影響,并探討其分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

36只成年雄性SD大鼠,20月齡,體重(550±20)g由北京斯貝福生物技術有限公司[SCXK(京)2016-0002]提供。所有大鼠每籠四只,在受控溫度(22±1)℃和濕度(55±5)%條件下,以12 h的明暗循環進行飼養。食物和水可以自由食用。大鼠的組織取材于河北醫科大學實驗動物中心[SYXK(冀)2019-0004]。動物的使用及實驗操作按照河北醫科大學實驗動物管理委員會(IACUC-JY-2018-075)的規定執行。實驗過程中依照3R原則給予所有動物人道主義關懷。

1.1.2 細胞

圖1 GES-1細胞Figure 1 GES-1 cell

1.2 主要試劑與儀器

睪丸酮購自北京Solarbio公司(批號:G0712);組織線粒體分離試劑盒(批號:M10274)、ATP檢測試劑盒(批號:S33279)購自上海Beyotime公司;Mn-SOD、GSH-Px活性、GSH、GSSG和ROS試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號分別為:960734、970105、944382、983711、952326);Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號:BC705);Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本Dojindo公司(批號:741261);原位細胞死亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司(批號:15396021);Cyt c、Caspase-3或ALDH2抗體均購自美國Abcam公司(批號分別為:ab169407、ab184538、ab11397)。

Synergy2多功能檢測儀購自美國BioTek公司;Safire2酶標儀購自瑞士TECAN公司;Tanon 5200 Multi全自動化學發光購自上海天能科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 手術和治療

將大鼠隨機分為3組:假手術組(Sham,n=12)、模型組(GDX,n=12)和補充雄激素(androgen,AG)的模型大鼠(n=12)。模型大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,并在無菌條件下接受雙側睪丸切除術,包括睪丸、附睪和附睪脂肪的切除。切口用外科釘閉合。假手術組大鼠除雙側睪丸切除術外均接受相同的手術治療。對于AG組,在下午5:00～6:00將睪丸酮(13.6 mg/(kg·d),溶于芝麻油中)灌胃到大鼠體內。其他組使用芝麻油進行治療。大鼠連續治療28 d,進行以下實驗。

1.3.2 生化分析

在最后1次治療后24 h內,大鼠麻醉處死。切除大鼠的胃并用冰冷的生理鹽水沖洗,用玻片刮取胃粘膜,采用組織線粒體分離試劑盒分離胃粘膜線粒體,檢測線粒體中Mn-SOD、GSH-Px、GSH、GSSG、GSH/GSSG和ROS水平。具體操作為:將胃粘膜在冰冷的緩沖液(10 mmol/L HEPES,pH=7.5,包括200 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖、1.0 mmol/L EGTA、2.0 mg/mL血清白蛋白)中均質,并在4℃下1000 r/min離心10 min。取上清液在4℃下3500 r/min離心10 min,以收集線粒體顆粒。采用試劑盒測定Mn-SOD、GSH-Px活性及GSH、GSSG和ROS的含量。

根據國內企業的財務軟件現實使用來看，軟件內部的每一個核算子系統之間互相分割，財務數據、信息傳輸的實時性、一致性、系統性較差，每一個子系統模塊之間相互獨立，缺乏有效的聯系。各個版本的財務軟件大多不能有效地結合使用，從而使得財務電算化的系統獨立于子系統，而數據交換、信息共享、控制管理等也無法有效開展。

1.3.3 線粒體膜電位

將胃粘膜碎片用平衡鹽溶液研磨,并通過尼龍網篩過濾。收集細胞并在37℃的Rh123溶液(10 μg/mL)中培養30 min。在清洗并重新懸浮在1 mL PBS中后,立即通過流式細胞儀(激發/發射波長,488 nm/534 nm)對細胞進行分析。

1.3.4 ATP水平測定

使用ATP檢測試劑盒檢測ATP。具體操作為,將大鼠胃粘膜勻漿于150 μL溶解緩沖液中,于4℃下12000 r/min離心10 min以收集細胞上清液。在96孔板中加入100 μL ATP檢測工作液,然后將收集到的50 μL細胞上清液添加到孔中,并立即使用Synergy2多功能檢測儀測量562 nm處吸光值。ATP水平=ATP濃度/蛋白質濃度。

1.3.5 細胞凋亡檢測

用Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。取處理后細胞,用冷磷酸鹽緩沖鹽水沖洗。將細胞(1×105個)重新懸浮在100 μL膜聯蛋白結合緩沖液中,然后添加5 μL FITC膜聯蛋白V和1 μL PI工作液。室溫孵育15 min后,加入400 μL膜聯蛋白結合緩沖液并混合,然后用流式細胞儀分析樣品。

1.3.6 細胞培養和分組

將人永生胃粘膜細胞GES-1接種在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基中培養。將細胞分為以下幾組:(1)對照組,(2)H2O2組,(3)AG組(含20% AG),(4)Disulfiram組(含5 μmol/L ALDH2抑制劑Disulfiram),(5)Disulfiram+AG組(含5 μmol/L Disulfiram+20% AG)。除對照組外,其余各組均用100 μmol/L H2O2處理6 h,進行以下實驗。

1.3.7 細胞活力測定

在孵育6 h后,采用Cell Counting Kit-8試劑盒測量GES-1細胞增殖。將100 μL的混合物(CCK-8與無血清培養基按體積比1:10混合)添加到各孔中,繼續孵育1 h,然后使用Safire2酶標儀通過測量450 nm和600 nm之間的光密度差來確定存活細胞的數量。所有實驗均重復3次。

1.3.8 TUNEL分析

將GES-1細胞(3×105個/孔)接種于載玻片上,37℃培養24 h,用100 μmol/L H2O2處理6 h,再用4%多聚甲醛固定。使用原位細胞死亡檢測試劑盒進行TUNEL分析。用熒光顯微鏡對載玻片進行分析和成像。所有實驗均重復3次。

1.3.9 Western blot分析

將胃粘膜在RIPA緩沖液中勻漿,在4℃以12000 r/min離心20 min,收集上清液。將蛋白質樣品(20～50 μg)加載在12%聚丙烯酰胺凝膠上,電泳轉移到PVDF膜。將膜暴露于封閉緩沖液中2 h,在4℃下與一級抗體Cyt c(1∶200)、Caspase-3(1∶1000)或ALDH2(1∶1000)抗體孵育過夜。然后在室溫下與HRP結合的二級山羊抗兔IgG(1∶2000)和山羊抗鼠IgG(1∶5000)一起孵育1 h。最后用化學發光法在Tanon 5200 Multi全自動化學發光觀察結果。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 雄激素對GDX老年大鼠氧化指標的影響

假手術、GDX與AG組間ROS、Mn-SOD、GSHPx、GSH和GSSG水平存在顯著差異(P＜0.001)。與Sham組相比,GDX組ROS和GSSG水平顯著增加(P＜0.05),而Mn-SOD、GSH-Px、GSH、GSH/GSSG水平顯著降低(P＜0.05)。在雄激素治療后,GDX老年大鼠上述變化顯著逆轉(P＜0.05)(表1)。

表1 GDX和雄激素給藥對胃黏膜線粒體ROS、Mn-SOD、GSH-Px、GSH和GSSG水平的影響Table 1 Effects of GDX and androgen on the levels of ROS,Mn-SOD,GSH Px,GSH and GSSG in gastric mucosa mitochondria

2.2 雄激素對GDX老年大鼠胃粘膜線粒體膜電位、ATP水平和Cyt c蛋白影響

假手術、GDX與AG組間線粒體膜電位、ATP水平、細胞質Cyt c蛋白和線粒體Cyt c蛋白存在顯著差異(F=33.126、24.412、55.518、89.742,均P＜0.001)。事后檢驗顯示,與Sham組相比,線粒體膜電位、ATP水平和線粒體Cyt c蛋白表達均顯著降低(P＜0.05),而細胞質Cyt c蛋白表達顯著增加(P＜0.05)。在雄激素治療后,GDX老年大鼠上述變化顯著逆轉(P＜0.05)(圖2)。

圖2 GDX和雄激素給藥對胃粘膜的影響Note.A,ATP level.B,Membrane potential.C～E,Cyt C protein expression.Compared with Sham group,*P＜0.05.Compared with GDX group,#P＜0.05.Figure 2 Effects of GDX and androgen in gastric mucosa

2.3 雄激素對GDX老年大鼠胃粘膜細胞凋亡分析

假手術、GDX與AG組間胃粘膜細胞凋亡和ALDH2、裂解的Caspase-3蛋白表達存在顯著差異(F=35.416、28.291、27.526,均P＜0.001)。事后檢驗顯示,與Sham組相比,胃粘膜細胞凋亡和裂解的Caspase-3蛋白表達均顯著增加(P＜0.05),而ALDH2蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。在雄激素治療后,GDX老年大鼠上述變化顯著逆轉(P＜0.05)(圖3)。

圖3 GDX和雄激素給藥對胃粘膜細胞凋亡影響Note.A,Cell apoptosis was detected by flow cytometry.B～D,Western blot was used to analyze the expression of ALDH2 and Caspase-3.Compared with Sham group,*P＜0.05.Compared with GDX group,#P＜0.05.Figure 3 Effects of GDX and androgen on apoptosis of gastric mucosal cells

2.4 雄激素降低H2O2處理的GES-1細胞氧化應激相關損傷

ALDH2是一種線粒體基質蛋白,在肝、腎、心、肺和胃腸道等多種組織中有組成性表達。ALDH2在由氧化應激誘導的脂質過氧化產生的ROS清除中起著重要作用[7]。研究進一步考察雄激素是否通過激活ALDH2保護氧化應激誘導的胃粘膜細胞凋亡。采用Disulfiram抑制GES-1細胞中ALDH2表達,Western blot分析顯示,GES-1細胞暴露于H2O2或者加入Disulfiram后,ALDH2蛋白表達明顯降低,而加入雄激素可增強ALDH2蛋白表達(圖4 A)。此外,與對照組相比,H2O2組細胞活力顯著降低(P＜0.05),細胞凋亡數目明顯增加(P＜0.05)。雄激素處理顯著逆轉了H2O2對GES-1的損傷作用(P＜0.05),并減少了細胞凋亡數目(P＜0.05);然而,當聯合加入Disulfiram時,雄激素的治療活性明顯降低(P＜0.05)(圖4B～G)。此外,雄激素處理顯著逆轉了H2O2誘導的GSH活性和GSH/GSSG比例降低,和GSSG活性增加;當聯合加入Disulfiram時,這種逆轉作用降低。

圖4 雄激素降低H2O2處理的GES-1細胞氧化應激相關損傷Note.A,Expression of ALDH2 protein was analyzed by Western blot.B,CCK-8 was used to detect cell viability.C,D,TUNEL method was used to detect the apoptosis.E～G,GSH and GSSG levels,and GSH/GSSG ratio.Compared with control group,*P＜0.05.Compared with H2O2 group,#P＜0.05.Compared with Disulfiram+AG group,&P＜0.05.Figure 4 Androgen reduced oxidative stress-related injury in GES-1 cells treated with H2O2

3 討論

在本研究中,我們發現雄激素影響GDX老年大鼠胃黏膜氧化應激參數、線粒體功能和凋亡。雄性GDX老年大鼠線粒體ROS和GSSG水平升高,線粒體Mn-SOD、GSH-px和GSH活性降低,線粒體膜電位和ATP水平降低。GDX也增加了胃粘膜細胞凋亡以及胞漿Cyt c和裂解Caspase-3的表達,并降低線粒體Cyt c的表達。這些數據支持雄激素在維持胃粘膜線粒體功能中起著重要作用,線粒體作為潛在的雄激素靶點與大鼠胃黏膜細胞凋亡有關。

線粒體作為ROS的主要來源和ROS損傷的主要靶點,受到外源性ROS清除和內源性ROS刺激的影響[8]。Mn-SOD和GSH-PX存在于線粒體基質或線粒體膜間空間。其中,Mn-SOD能催化超氧自由基轉化H2O2,從而清除毒素。GSH-Px催化線粒體H2O2的還原,使GSH生成GSSG[9]。GSH水平和GSH/GSSG比值的降低被認為是氧化還原失衡的證據[9]。本研究發現,GDX老年大鼠胃黏膜線粒體ROS升高,Mn-SOD、GSH-Px和GSH/GSSG水平降低,提示GDX老年大鼠存在氧化應激。抗氧化防御和氧化損傷的惡化與線粒體功能障礙密切相關[4]。線粒體功能障礙又會導致更多的自由基生成,并降低抗氧化能力[10]。補充雄激素可恢復GDX老年大鼠胃黏膜線粒體膜電位和ATP水平。因此,研究結果表明雄激素可以通過調節線粒體功能提供抗氧化作用。線粒體膜電位的降低與凋亡相關的線粒體功能障礙相關,這會導致活性氧的生成,并啟動線粒體介導的凋亡信號[11]。

ROS參與了細胞凋亡的誘導。以前的研究表明,細胞內ROS的產生可能是一個保守的凋亡事件[12]。線粒體在內源性凋亡途徑中起著關鍵作用。高濃度ROS暴露可引起線粒體釋放Cyt c[13]。內源性途徑的誘導依賴于Cyt c從線粒體釋放到細胞質,并誘導與凋亡細胞死亡有關的細胞內蛋白質水解,特別是Caspases-3[14]。在本研究中,我們發現GDX雄性大鼠胃粘膜細胞凋亡明顯增加,伴隨著Cyt c從線粒體釋放到胞漿中的增加,及Caspase-3的激活。補充雄激素可逆轉這些變化,表明雄激素缺乏誘導GDX老年大鼠胃黏膜細胞凋亡,涉及線粒體介導的凋亡途徑參與。衰老可能增加患消化性潰瘍病的風險。一些研究表明,老化的胃粘膜隨著脂質過氧化氫和Caspase-3表達的增加而受損[15]。因此,雄激素可能是預防消化性潰瘍病的潛在藥物。

ALDH2是一種由位于染色體12q24的核基因編碼的線粒體基質蛋白,該蛋白是一種具有56×103相同亞基的四聚體酶[7]。ALDH2在由氧化應激誘導的脂質過氧化產生的ROS清除中起著重要作用[16]。本研究發現,在GDX老年大鼠胃黏膜中ALDH2水平降低,補充雄激素可恢復ALDH2水平。因此,我們進一步驗證了雄激素是否通過激活ALDH2減輕胃粘膜細胞氧化應激相關損傷。體外分析結果顯示,ALDH2抑制劑Disulfiram降低雄激素對GES-1細胞損傷的保護作用,證實了雄激素通過激活ALDH2來減輕GDX老年大鼠胃黏膜細胞損傷。

綜上所述,雄激素缺乏導致老年大鼠胃粘膜細胞線粒體功能障礙和線粒體ROS積累增加,誘導胃黏膜細胞凋亡,這種損害作用至少部分與ALDH2的抗氧化功能抑制有關。