基于Image J軟件對BALB/c突變卷毛鼠肝腫瘤的定量分析

李曉娟李興杰孫慧偉姜棋予柴燕濤高 蓉李 潤李瑞生*湯紫榮

(1.解放軍總醫院第五醫學中心感染病醫學部,北京 100039;2.解放軍總醫院第五醫學中心住院與病案管理科,北京 100039)

原發性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國乃至全世界最常見的惡性腫瘤之一,其發病率逐年升高,對我國公共衛生事業提出了重大挑戰[1]。受到肝癌診斷與臨床治療技術的限制,大多數患者直到發展為進展期或晚期才確診,肝腫瘤已呈多發或彌散性腫瘤病灶,同時轉移與侵襲能力較強[2-3],因此進展期肝癌的各項研究逐漸成為了熱點。而動物模型在研究過程中起到非常重要的作用,但目前尚未有最合適的進展期肝癌動物模型,因此需建立更加直觀且便捷的動物模型。同時在肝癌建模的評價中,對腫瘤定性研究使用較多,對腫瘤組織等圖片進行定量分析則較少見。BALB/c卷毛鼠是本實驗室發現的自發突變小鼠,前期研究表明突變基因對該鼠的各個系統尤其是免疫系統產生了一定的影響[4-5]。因此本實驗利用BALB/c突變卷毛鼠與正常BALB/c小鼠構建經肝門靜脈注射后形成多發與彌散的肝腫瘤病灶,利用Image J軟件直觀地對兩組小鼠的腫瘤病灶比例進行定量分析與對比分析,以期了解突變鼠與正常小鼠在構建進展期肝癌腫瘤模型之間的差異性,為今后更好得開發和利用本突變鼠作為具有優勢的進展期肝癌動物模型提供堅實的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

KM小鼠,3只,SPF級,雌性,6周齡,體重18～20 g;BALB/c小鼠10只,SPF級,雌性,5～6周齡,體重16～18 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2016-0002]。BALB/c卷毛鼠10只,SPF級,雌性,5～6周齡,16～18 g,來源于本實驗室近交培育。動物飼養在解放軍總醫院第五醫學中心動物實驗中心[SYXK(軍)2017-0016]。本實驗嚴格按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷,通過了解放軍總醫院第五醫學中心動物倫理委員會審查(IACUC-2017-006)。

1.1.2 細胞

H22肝癌細胞株來自本院中心實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清等購自美國Hyclone公司;吸入性麻醉劑異氟烷購自上海玉研科技有限公司;全套解剖手術器械由本實驗室提供,購自上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠;圖像分析軟件為Adobe Photoshop(CS6)和Image J軟件(美國國立衛生研究院,1.51j8)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養實驗

在KM小鼠體內腹腔注射復蘇后的H22細胞株,待小鼠腹部隆起后,用無菌注射器抽取腹水,用生理鹽水洗滌后經1000 r/min離心(5 min),棄上清液。用生理鹽水將H22肝癌細胞數調整至每毫升1×107個備用。

1.3.2 構建進展期肝癌模型

將兩組小鼠依次使用異氟烷進行麻醉。在小鼠胸骨下緣正中處開一個1.5 cm的豎形開口。將肝葉輕輕擠出并上翻放置于預置的濕潤紗布上,即可清晰地看到與下腔靜脈伴行的肝門靜脈。使用1 mL滅菌注射器吸取備用細胞懸液,輕輕扎入肝門靜脈,緩慢注射。注射體積為100 μL,細胞量約為1×106個。注射完畢,輕壓止血后,快速將肝葉置入腹腔內,縫合消毒傷口。術后每日觀察兩組小鼠的恢復狀態,待21 d后采集肝。

1.3.3 利用Image J軟件對肝彌散病灶進行定量分析

選擇獲得的兩組肝組織的最大肝葉,首先拍照獲得垂直視角圖片。進而對拍照所得的肝照片進行圖像定量分析,具體分析步驟參考姜棋予等[6]的方法。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件分析數據,計量資料以平均數±標準差(±s)表示,采用獨立樣本t檢驗進行兩組分析比較,P＜0.05與P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝多發彌散性腫瘤外觀對比結果

結果顯示:卷毛鼠組和正常小鼠組在相同的造模時間內均形成了多發性彌散性的肝腫瘤。肉眼觀察發現卷毛鼠組的彌散性腫瘤占據肝的比例顯著多于正常小鼠組,而且觀察到腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關系更加密切(圖1)。

圖1 兩組小鼠肝彌散性腫瘤外觀對比結果Figure 1 Comparison of the appearance of liver diffuse tumor between the two groups

2.2 肝多發彌散性腫瘤病灶圖像定量對比分析

結果顯示:首先用Photoshop軟件沿肝邊緣截取得到肝整個背景圖片(圖2A),再用Image J軟件獲得了圖片的RGB象限分析結果(圖2B、2C、2D),選擇對比度相對高的圖2D進行分析。分別獲得了卷毛鼠和正常小鼠肝整體比例圖與肝腫瘤比例圖(圖3)。其中一只卷毛鼠的肝占圖片總面積的37.54%,腫瘤組織占圖片總面積的21.23%(圖3A),而一只正常小鼠肝占圖片總面積的35.19%,腫瘤組織占圖片總面積的11.84%(圖3B)。建立了基于圖像分析軟件Image J的肝照片定量分析方法。

圖2 肝照片的選定及像限分析結果Note.A,All areas of liver organs were selected.B(Red),C(Blue),D(Green),Analysis results of three RGB image limits.Red arrow shows multiple and diffuse tumors in the liver.Figure 2 Selection of liver photos and results of image limit analysis

圖3 肝總面積和腫瘤病灶識別預算定量分析Note.A,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in curly mice.B,Liver ratios(top)and tumor ratios(bottom)in normal mice.Figure 3 Quantitative analysis of total area of liver organs and budget of tumor focus identification

2.3 肝多發彌散性腫瘤比例對比分析

結果顯示:兩組小鼠的肝比例不具有顯著性差異,而卷毛鼠的腫瘤比例和腫瘤占肝的比例均顯著大于正常小鼠(P＜0.01)(見表1)。

表1 兩組小鼠彌散性腫瘤比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

表1 兩組小鼠彌散性腫瘤比較(±s,n=10)Table 1 Comparison of diffuse tumor between the two groups

注:與正常小鼠相比,*P＜0.01。Note.Compared with normal mice,*P＜0.01.

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3 討論

依托實驗動物建立肝細胞癌模型是肝細胞癌分子靶向治療研究以及分子藥理學研究的基礎[7]。近年來可見利用門靜脈注射方法構建進展期或轉移性肝癌模型。劉毅等[8]建立肝癌細胞門靜脈轉移模型,研究發現部分機制可能是通過上調基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達實現。柴燕濤等[9]利用肝門靜脈注射不同肝癌細胞系建立新型進展期肝腫瘤模型,為肝癌相關臨床藥物的篩選奠定了堅實基礎。同時,研究者更傾向于利用各種成熟的圖像成像技術來反映腫瘤的進展情況。余琦等[10]利用Image J軟件對家兔動脈粥樣硬化病變圖像進行定量分析,能夠準確和有效的評估動脈粥樣硬化病變程度。張鑫等[11]利用Image J軟件建立白癜風白斑面積的數字化測量方法,為臨床客觀評價皮損的嚴重程度及其動態變化提供可靠且簡便易行的圖形面積數字化操作流程。而利用門靜脈注射腫瘤細胞構建自發突變小鼠進展期肝細胞癌模型,并利用Image J軟件對腫瘤進行觀察的報道尚未見到。

因此,本研究在前期發現突變卷毛鼠與正常小鼠構建皮下移植和原位肝移植模型之間存在顯著差異的基礎上,應用門靜脈注射腫瘤細胞構建進展期肝細胞癌模型,進而對兩組小鼠的差異性進行比較。結果顯示:兩組小鼠的肝均形成明顯的彌散性腫瘤。但卷毛鼠組彌散性腫瘤占據肝的比例顯著多于正常小鼠組,而且腫瘤與周邊的正常肝組織浸潤關系更加密切,與前期其他方式移植腫瘤的研究結果相一致[12]。現研究中腫瘤轉移動物模型多采用經尾靜脈注射,腫瘤細胞經下腔靜脈回心后經由肺動脈抵達肺部[13],難以到達肝,很難直觀反映與模擬進展期肝腫瘤的特性[14-15]。而本實驗選擇經肝門靜脈直接注射腫瘤細胞,腫瘤細胞不僅可隨肝內部豐富的血流迅速到達肝各個部位,還可長時間留駐肝內部,尤其在接近肝包膜處毛細血管豐富,能夠很好形成多發彌散性的腫瘤病灶。同時皮下腫瘤和原位腫瘤模型多為單個,可通過測量計算其腫瘤體積進行量化分析,獲得照片等圖像信息也較為容易。但對于多發性和彌散性腫瘤的量化分析則有難度。曾有研究者以高內涵等為代表的圖像采集與分析系統,但整個工作站價格昂貴,而且對于圖形文件格式的要求較為嚴格,因此普及性較差[16-17]。本實驗采用Image J軟件可直觀的對彌散性腫瘤圖片進行定量分析,得出卷毛鼠與正常小鼠肝比例分別為(37.82±1.31)%和(36.21±1.85)%、腫 瘤 比 例 分 別 為(20.43±4.03)%和(9.20±2.01)%、腫瘤占肝比分別為(53.79±9.11)%和(25.35±5.16)%,卷毛鼠與正常小鼠的肝比例不具有顯著性差異,而卷毛鼠的腫瘤比例和腫瘤占肝的比例均顯著大于正常小鼠(P＜0.01),不僅建立了Image J軟件對彌散性腫瘤進行圖像定量分析的方法,而且進一步驗證了卷毛鼠的肝癌成模能力強于正常小鼠。

綜上所述,BALB/c突變卷毛鼠經門靜脈注射腫瘤細胞形成多發彌散性腫瘤的能力優于正常BALB/c小鼠,同時利用Image J軟件對彌散性腫瘤進行定量分析,進一步驗證了BALB/c突變卷毛鼠在肝腫瘤成模方面的優勢所在,以期該突變卷毛鼠能夠成為開展肝癌動物模型各項研究的成熟實驗平臺。