替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝研究

徐艷艷，鄭麗君，張霞燕，吳振波，朱延焱，王海翔，田吉來

(1.麗水市中心醫(yī)院，浙江 麗水 323000；2.中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇 南京 211198；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

替加環(huán)素(tigecycline)，化學(xué)名為((4S,4aS,5aR.12aS)-4,7-雙(二甲氨基)-9-[(叔丁基氨基)乙酰氨基]-3,10,12,12a-四羥基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氫并四苯-2-甲酰胺，是由美國惠氏公司研制的一種具有超廣譜抗菌活性的新型甘氨酰環(huán)素類抗生素[1-2]，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有廣泛抗菌活性，尤其對鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等具有很好作用[3-4]。替加環(huán)素為橘黃色粉末狀物質(zhì)，是一種水溶的弱酸性化合物，logP為1.677 40。替加環(huán)素不穩(wěn)定，其水溶液在空氣中易發(fā)生氧化降解和差向異構(gòu)化，加熱和攪拌會加速其反應(yīng)進(jìn)行，差向異構(gòu)化后的替加環(huán)素不再具有抗菌活性[5-6]。替加環(huán)素需要被保存在-60 ℃中。另外目前市面上替加環(huán)素以凍干粉針劑為主要劑型，存在靶向性不強(qiáng)、無法通過血腦屏障等缺點，在治療顱內(nèi)感染時療效較差。

提高藥物穩(wěn)定性一般有環(huán)糊精包埋、PEG分子修飾、平衡離子成鹽、藥物分子框架技術(shù)、做成其他載藥體系(如微囊、脂質(zhì)體、膠束等)等方法[1]。其中，脂質(zhì)體是在20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的一種具有脂質(zhì)雙分子層的超微球形載體制劑。脂質(zhì)體可以將藥物包裹在內(nèi)水相或者脂層，防止藥物受外界環(huán)境影響而降解。除此之外，它還具有如下特點:①通過修飾脂質(zhì)體表層可以達(dá)到靶向治療作用；②修飾后可以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，提高藥物利用度，減少藥物劑量，提高藥效、降低不良反應(yīng)等；③生物相容性良好，易于通過生物屏障(血腦屏障、肺部黏液屏障等)；④抵抗對藥物的耐藥性等[2]。因此，為了提高替加環(huán)素的穩(wěn)定性，改善替加環(huán)素的生物利用度，本研究擬制備替加環(huán)素脂質(zhì)體，采用離心法進(jìn)行包封率測定，并采用響應(yīng)面法進(jìn)行制備工藝優(yōu)化。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 ATX224型電子天平(株式會社島津制作所)；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；HH-42型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱(常州國華電器有限公司)；PHS-3C型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LC-15C型高效液相色譜儀[島津企業(yè)管理(中國)有限公司]；TGL-16G型臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KH-100B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品(含量99%，批號：291641，北京百靈威科技有限公司)；大豆卵磷脂(食品級，江蘇源盛通生物工程有限公司)；膽固醇(批號：20181128，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；無水乙醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；二氯甲烷(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法

2.1 替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備 精密稱取10 mg替加環(huán)素和適量的膽固醇和大豆磷脂于500 mL圓底燒瓶中，加入二氯甲烷溶解，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)制得磷脂膜，加入pH為7.2的PBS緩沖液50 mL，水浴加熱30 min后超聲分散5 min，得到均一的黃色溶液，吸取適量溶液過0.45 μm水系微孔濾膜，得到替加環(huán)素脂質(zhì)體，在4 ℃冰箱中保存[9]。

2.2 脂質(zhì)體中替加環(huán)素含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：UItimate XB-C18(4.5 mm×150 mm，3 μm)，柱溫：室溫25 ℃，流動相：PBS-EDTA緩沖液∶乙腈=75∶25，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：248 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5 mg替加環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，用“2.2.1”項下流動相配制成0.2 mg·mL-1替加環(huán)素儲備液，吸取一定量替加環(huán)素儲備液，以流動相作為溶劑梯度稀釋獲得濃度為100、80、40、20、10 μg·mL-1對照品溶液。

2.2.3 線性范圍考察 對照品溶液按“2.2.1”項下的色譜柱條件進(jìn)行HPLC測定，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到方程為Y=50 526X-107 253，R2為0.999，線性范圍為10～100 μg·mL-1。

2.3 建立替加環(huán)素脂質(zhì)體包封率測定方法 將制備好的替加環(huán)素脂質(zhì)體溶液高速離心(15 000 r·min-1、15 min)，取上層清液，過0.22 μm的水系濾膜，用高效液相色譜儀檢測。按如下計算公式計算脂質(zhì)體包封率(EE)和載藥量，評價替加環(huán)素脂質(zhì)體的質(zhì)量，另設(shè)綜合評分指標(biāo)直觀評估替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝。

包封率(%)=(總替加環(huán)素-游離的替加環(huán)素)/總替加環(huán)素×100%

載藥量(%)=(總替加環(huán)素-游離的替加環(huán)素)/磷脂用量×100%

綜合評分(%)=包封率×50%+載藥量×50%

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗 固定二氯甲烷體積和大豆磷脂用量，對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備過程中的水化溫度、藥脂比、膽脂比這3個因素進(jìn)行單因素考察。以高速離心法聯(lián)合高效液相色譜法測定替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率。

3.1.1 對水化溫度的考察 固定藥脂比為1∶20，膽脂比為1∶5，設(shè)置水化溫度分別是30、40、50、60、70 ℃，按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量，如圖1所示。

圖1 不同水化溫度對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

結(jié)果顯示，其他參數(shù)條件不變時，70 ℃水化溫度下制備的替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率和載藥量都最高，但在放置4 d后該試驗所得的所有替加環(huán)素脂質(zhì)體受不同水化溫度影響而呈現(xiàn)不同程度的顏色變化，且越高的水化溫度其顏色變化越深。考慮到替加環(huán)素在高溫中不穩(wěn)定易變質(zhì)，因此棄用70 ℃水化溫度，改用包封率、載藥量次之的60 ℃的水化溫度。

3.1.2 對替加環(huán)素和總脂質(zhì)量比的考察 固定水化溫度為60 ℃，膽脂比為1∶5，設(shè)置藥脂比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量，如圖2所示。

圖2 不同藥脂比對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

結(jié)果顯示，隨著藥脂比的增大，包封率依次增大，而載藥量依次降低。而在綜合評分上，當(dāng)藥脂比為1∶30時，數(shù)值最大。

3.1.3 對膽固醇和大豆磷脂質(zhì)量比的考察 固定水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶20，設(shè)置膽脂比分別為1∶2、1∶4、1∶5、1∶6、1∶8，按上述方法制備替加環(huán)素脂質(zhì)體并測定其包封率及載藥量，如圖3所示。

圖3 不同膽脂比對替加環(huán)素脂質(zhì)體品質(zhì)的影響

結(jié)果顯示，當(dāng)膽脂比是1∶6時，替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率和綜合評分都達(dá)到了最高，而載藥量最高的膽脂比則是1∶5。綜合考慮，當(dāng)膽脂比為1∶6時，制得的替加環(huán)素脂質(zhì)體的品質(zhì)最優(yōu)。

3.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化處方 根據(jù)單因素考查、正交試驗以及Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計的原理，確定主要影響制備的因素為水化溫度(A)、藥脂比(B)、膽固醇與大豆磷脂質(zhì)量比(C)，以替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率、載藥量和綜合評分為響應(yīng)值，每個因素設(shè) 3個水平，進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗[10]。響應(yīng)面試驗的因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗的因素與水平設(shè)計表

響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

3.2.1 以包封率為響應(yīng)值觀察 利用Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合分析，結(jié)果顯示(見表3和圖4)，包封率與A、B、C 呈顯著線性關(guān)系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為包封率=56.77+2.28×A+9.33×B+9.4×C，即包封率=56.772 94+2.277 5×溫度+9.332 5×藥脂比+9.4×膽脂比。

表3 包封率的響應(yīng)面方差分析表

模型F值為16.57意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在這種情況下，B、C是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項P>0.1，不顯著，試驗誤差較小，因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

A.溫度對包封率的影響效果圖；B.藥脂比對包封率的影響效果圖；C.膽脂比對包封率的影響效果圖圖4 單因素對包封率的影響效果圖

替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝中影響包封率的主次因素順序為C>B>A，即膽脂比的影響最大，藥脂比次之，水化溫度的影響最小。以包封率為指標(biāo)，最佳處方工藝為A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

3.2.2 以載藥量為響應(yīng)值觀察 利用Design-Expert 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，結(jié)果顯示(見表4和圖5)模型的擬合曲線方程為載藥量=3.56+0.25×A-1.54×B+0.24×C-0.27×A×B+0.098 ×A×C-0.8×B×C-0.31×A2+1.02×B2+0.18×C2，即載藥量=3.556+0.247 5×溫度-1.536 25×藥脂比+0.238 75×膽脂比-0.267 5×溫度×藥脂比+0.097 5×溫度×膽脂比-0.805×藥脂比×膽脂比-0.305 5×溫度2+1.022×藥脂比2+0.177×膽脂比2。

模型F值為32.65意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在本例中，B、BC、B2是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項不顯著，因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表4 載藥量的響應(yīng)面方差分析表

A.溫度與藥脂比對載藥量的影響效果圖；B.溫度與膽脂比對載藥量的影響效果圖；C.膽脂比與藥脂比對載藥量的影響效果圖圖5 不同因素對載藥量的影響效果圖

在溫度與藥脂比的交互作用效果圖中可知，藥脂比的等高線分布較溫度的等高線分度密集，且響應(yīng)面3D圖形在藥脂比維度上的坡度變化較大。因此認(rèn)為在替加環(huán)素脂質(zhì)體的制備工藝中，溫度的影響更為顯著，這一結(jié)論與表4中的因素顯著性結(jié)果一致。

根據(jù)載藥量由Design Expert軟件獲得的最佳處方工藝為A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

3.2.3 以綜合評分為響應(yīng)值觀察 根據(jù)Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合分析，結(jié)果顯示(見表5和圖6)，包封率與A，B，C 呈顯著線性關(guān)系(P<0.01)。得到模型的擬合曲線方程為綜合評分=30.37+1.26×A+3.9×B+4.82×C，即綜合評分=30.374 71+1.262 5×溫度+3.898 12×藥脂比+4.819 38×膽脂比。各因素影響效果見圖6。

A.溫度對綜合評分的影響效果圖；B.藥脂比對綜合評分的影響效果圖；C.膽脂比對綜合評分的影響效果圖圖6 不同因素對綜合評分的影響效果圖

模型F值為12.16意味著模型是顯著的?！癙rob>F”值小于0.050 0表示模型項是顯著的。在這種情況下，B、C是重要的模型項。大于0.100 0的值表示模型項不重要。該模型的失擬項不顯著[8]，因此可用此模型對替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

表5 綜合評分的響應(yīng)面方差分析表

替加環(huán)素脂質(zhì)體制備工藝中影響綜合評分的主次因素順序為C>B>A，即膽脂比的影響最大，藥脂比次之，水化溫度的影響最小。以綜合評分為指標(biāo)，最佳處方工藝為 A1B1C0，即水化溫度為60 ℃，藥脂比為1∶30，膽脂比為1∶5。

4 討論與結(jié)論

制備脂質(zhì)體過程中，膽固醇作為膜的流動性調(diào)節(jié)劑，大豆磷脂和膽固醇比例的變化對膜的形成有關(guān)鍵影響；成膜后加入水化液在一定溫度下可形成脂質(zhì)體。包封率和載藥量是評價脂質(zhì)體制備工藝和質(zhì)量的重要指標(biāo)，包封率反映了藥物被載體包封的程度，包封率越高，藥物被利用的程度越高，成本越低；載藥量的大小直接影響到藥物的臨床應(yīng)用劑量，故載藥量愈大，愈易滿足臨床需要。因此，本實驗以包封率和載藥量為響應(yīng)值，通過單因素試驗考察了水化溫度、藥脂比、膽脂比等因素對制備工藝的影響，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化了脂質(zhì)體的制備工藝，得到了替加環(huán)素脂質(zhì)體的最優(yōu)工藝為水化溫度60 ℃、藥脂比為1∶30、膽脂比為1∶5，在此條件下制備的替加環(huán)素脂質(zhì)體的包封率為73.07%，載藥量為3.00%，綜合評分為38.03%。