硫代艾地那非薄層色譜-表面增強拉曼光譜定性研究

劉桂花，劉福堂，孫晶，張中湖

(1.山東阿卡迪亞藥業(yè)有限公司，山東 濟南 250101；2.山東京衛(wèi)制藥有限公司，山東 泰安 271000；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250101)

非法添加問題是個國際性難題，食品、中成藥、保健食品、化妝品[1-4]都有非法添加現(xiàn)象，常見檢測方法包括薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜(HPLC)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)、高效毛細管電泳(HPCE)、膠體金試劑盒法[5-10]等。薄層色譜-表面增強拉曼光譜(TLC-SERS)技術(shù)[11-13]，是將薄層分離功能與拉曼檢測功能相結(jié)合，并基于譜庫檢索功能的一項實用性技術(shù)，與上述方法相比，具有定性準(zhǔn)確優(yōu)點。本試驗以硫代艾地那非為目標(biāo)檢驗物，測試TLC-SERS的定性檢測能力，為非法添加的快速篩查提供新的技術(shù)支持。

1 試驗材料

1.1 儀器與系統(tǒng) 薄曼聯(lián)用儀，型號：KH4500薄層色譜掃描儀-R10拉曼光譜儀，聯(lián)用；TRAFIC系統(tǒng)，一種基于拉曼光譜的藥品快檢軟件，軟著登字第3925804號。

1.2 試劑與樣品 硫代艾地那非對照品(批號：520048-201401，中國食品藥品檢定院)；氯仿(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙酸乙酯(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；硝酸銀(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；水。

2 試驗方法

2.1 對照品溶液的制備 稱取硫代艾地那非對照品適量，加甲醇溶解，制成1.0 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。

2.2 水相銀溶膠的制備 稱取90 mg的硝酸銀于500 mL去離子水中加熱至沸騰，逐漸加入1%的檸檬酸三鈉溶液10 mL，同時劇烈攪拌，保持沸騰1 h，繼續(xù)攪拌至溶液冷卻，得到灰綠色的銀溶液。

2.3 樣品制備、點樣、展開、成像、點膠、圖譜采集、數(shù)據(jù)上傳和處理，形成報告。

薄曼聯(lián)用儀預(yù)熱，放置待測溶液、薄層板到相應(yīng)位置；工作站錄入樣品信息后，設(shè)置點樣參數(shù)(見圖1)，自動點樣。取出薄層板，于氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(40∶40∶15∶12)中展開，展距約8.0 cm，取出晾干，放回薄曼聯(lián)用儀； 254 nm成像確定點膠位置，設(shè)置點膠參數(shù)，自動點膠；點膠后每個斑點掃描1次，上傳至TRAFIC系統(tǒng)，與SERS標(biāo)準(zhǔn)庫遍歷比對，下載篩查報告。

圖1 薄曼聯(lián)用儀點樣設(shè)置界面

2.4 采集參數(shù)考察

2.4.1 點樣量考察 固定采集參數(shù)：點膠量：2 μL；積分時間：3 s；激光功率：100%；平均次數(shù)：1次，分別吸取對照品溶液1、2 μL，各點樣3次，于展開劑中展開后，于254 nm紫外燈下成像后考察不同點樣量對薄層色譜圖的影響。

2.4.2 點膠量 固定采集參數(shù)：點樣量：1 μL；積分時間：3 s；激光功率：100%；平均次數(shù)：1次，分別吸取水相銀溶膠1、2、3、4 μL進行試驗，考察點膠量對SERS光譜圖的影響。

2.4.3 積分時間 固定采集參數(shù)：點樣量：1 μL；點膠量：2 μL；積分時間：3 s；激光功率：100%；平均次數(shù)：1次，分別在積分時間1、2、3、4、5 s進行試驗，考察積分時間對SERS光譜圖的影響。

2.4.4 激光功率 固定采集參數(shù)：點樣量：1 μL；點膠量：2 μL；積分時間：3 s；平均次數(shù)：1次；分別在激光功率20、40、60、80、90、100進行試驗，考察激光功率對SERS光譜圖的影響。

2.4.5 平均次數(shù) 固定采集參數(shù)：點樣量：1 μL；點膠量：2 μL；積分時間：3 s；激光功率：100%；平均次數(shù)：分別在平均次數(shù)1～5進行試驗，考察平均次數(shù)對SERS光譜圖的影響。

2.5 檢出限考察 分別配置不同濃度(0.1、0.2、0.5、1 mg·mL-1)的硫代艾地那非的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度的樣品各點樣6次，按檢測的最佳光譜條件設(shè)置參數(shù)，以樣品斑點展開、成像后，根據(jù)樣品斑點在254 nm下顯像及樣品的SERS譜圖與標(biāo)準(zhǔn)庫中標(biāo)準(zhǔn)SERS譜圖(見圖2)的特征峰匹配度大于0.833判斷本品的檢出限。

圖2 硫代艾地那非SERS建庫譜圖

2.6 精密度考察 取1 mg·mL-1的對照品溶液，同一薄層板上點樣6次、展開、顯色、點膠后采集拉曼光譜上傳，計算各樣品的SERS譜圖與標(biāo)準(zhǔn)SERS譜圖的相似度、匹配度值。

2.7 水相銀溶膠對SERS影響考察 按“2.2”項下方法自制3個批次的水相銀溶膠(批號：20190410-1、20190410-2、20190412-1)，取約1 mg·mL-1的對照品溶液，每個批次的水相銀溶膠測定6個斑點。

3 試驗結(jié)果

3.1 樣品采集參數(shù)的確定

3.1.1 點樣量的考察結(jié)果 由圖3可知，當(dāng)點樣量為1 μL時，斑點呈窄細的條帶狀，而2 μL時，則出現(xiàn)樣品過載的現(xiàn)象，斑點較大，不易于斑點的定位，故將點樣量確定為1 μL。

圖3 不同點樣量的薄層展開圖(1～3點樣量為2 μL；4～6點樣量為1 μL)

3.1.2 點膠量的確定 由圖4可知，當(dāng)點膠量為2 μL時，樣品SERS譜響應(yīng)最高，再增大點膠量，不僅不能有效地提高樣品SERS譜響應(yīng)，反而提高樣品SERS譜的基線，故將點膠量設(shè)置為2 μL。

圖4 不同點膠量的拉曼檢測結(jié)果

3.1.3 積分時間的確定 由圖5可知，當(dāng)積分時間為3 s時，樣品SERS譜響應(yīng)最好，再增大積分時間，樣品SERS譜的峰高增加不明顯，故將積分時間設(shè)置為3 s。

圖5 不同積分時間的拉曼檢測結(jié)果

3.1.4 激光功率的確定 由圖6可知，樣品SERS譜響應(yīng)隨激光功率的增加而增強，當(dāng)激光功率為100%時，樣品SERS譜響應(yīng)最好，故將激光功率設(shè)置為100%。

圖6 不同激光功率的拉曼檢測結(jié)果

3.1.5 平均次數(shù)的確定 由圖7可知，樣品SERS譜響應(yīng)隨平均次數(shù)的增加而減弱，當(dāng)平均次數(shù)為1次時，樣品SERS譜響應(yīng)最高，故將平均次數(shù)設(shè)置為1次。

圖7 平均次數(shù)對拉曼檢測結(jié)果的影響

3.2 檢出限 在最佳采集參數(shù)、拉曼檢測條件(點樣量1 μL，點膠量2 μL，積分時間3 s，激光功率100%，平均次數(shù)1次)下，0.2 mg·mL-1硫代艾地那非對照品的樣品斑點展開、成像后，清晰可見、易于定位，詳見圖8；同一樣品溶液，連續(xù)點樣6次，設(shè)定相似度值高于0.95以及特征峰匹配度高于0.7，為判定硫代艾地那非SERS譜的快檢結(jié)果為摻雜的標(biāo)準(zhǔn)，故將檢出限定為0.2 mg·mL-1，快檢結(jié)果見表1，硫代艾地那非典型的快檢報告見圖9。

圖8 0.2 mg·mL-1硫代艾地那非連續(xù)點樣6次檢出限薄層展開圖

圖9 硫代艾地那非典型的快檢報告

表1 硫代艾地那非SERS譜檢出限快檢結(jié)果

3.3 重現(xiàn)性 點6個樣展開重現(xiàn)性結(jié)果見圖10，6個樣SERS譜與標(biāo)準(zhǔn)庫比對結(jié)果見表2。

圖10 1 mg·mL-1硫代艾地那非連續(xù)點樣6次重現(xiàn)性薄層展開圖

表2 硫代艾地那非SERS譜重現(xiàn)性快檢結(jié)果

相似度值的平均值0.97，RSD=0.28%，說明全譜相似度重現(xiàn)性良好；特征峰匹配從100%匹配到74%匹配，存在一定誤差。全譜相似度與特征峰匹配度計算方式有差異，特征峰匹配度更多體現(xiàn)差異部分，因此在相似度良好的情況下，特征峰匹配度有較大差異。

3.4 不同批次水相銀溶膠對硫代艾地那非SERS影響分析 3個批次水相銀溶膠，增強1 mg·mL-1硫代艾地那非的SERS見圖11，全譜輪廓基本一致，強度差異較大。3個批次水相銀溶膠對硫代艾地那非SERS的快檢結(jié)果，見表3，除20190410-1批次水相銀溶膠6個斑點的快檢結(jié)果均為摻雜外，其余兩個批次水相銀溶膠均有1個斑點的快檢結(jié)果為疑似，其余5個斑點的快檢結(jié)果均為摻雜。

圖11 不同批次水相銀溶膠作用下硫代艾地那非SERS對比圖

表3 不同批次水相銀溶膠對硫代艾地那非SERS的快檢結(jié)果

4 結(jié)論

本試驗以硫代艾地那非為研究對象，通過單因素影響試驗確定了硫代艾地那非TLC-SERS的最佳采集參數(shù)和檢測條件，在此基礎(chǔ)上研究了硫代艾地那非的檢測限、重現(xiàn)性及不同水相銀溶膠對硫代艾地那非SERS的影響，為樣品SERS檢測條件的確定、方法學(xué)的初步考察提供了參考。

隨著檢測體系的升級改造，從聯(lián)用儀優(yōu)化為一體機，拉曼光譜儀成為薄層色譜掃描儀的檢測器，該方法將從研究實驗室走向市場，借助TRAFIC系統(tǒng)和互聯(lián)網(wǎng)，為食品、中成藥、保健食品、化妝品等的非法添加快速篩查，提供行之有效的TLC-SERS方法、儀器、標(biāo)準(zhǔn)支持。