去甲漢黃芩素抗膿毒癥潛在靶點的篩選與鑒定

柏慧，王新會，婁佳悅，李小清，陳桂榮

(遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

膿毒癥是重度燒傷、創傷、感染、休克和大手術等后常見的并發癥，由于宿主無法對感染的反應進行調控，繼而引發的全身炎癥反應癥候群，是臨床危重患者的主要死亡原因之一[1-3]。由流行病學研究可知，世界上每年有兩千萬左右的膿毒癥患者，其中進展為重癥膿毒癥(severe sepsis)或膿毒癥休克(septic shock) 大約30%～40%，致死率高達25%～70%[4]。目前，關于膿毒癥的發病機制的認識正在不斷深入，但是對膿毒癥有效的治療方法的研究卻未能取得較好的成效。并且，當前并無確切有效的臨床用藥。因此，對于預防和治療膿毒癥的有效藥物和治療方法的研究，是具有臨床意義和未來應用價值的。

以往的研究表明黃連解毒湯對膿毒癥具有良好的治療作用，黃連解毒湯中含有的成分之一去甲漢黃芩素(見圖1)是一種黃酮類化合物，黃連解毒湯在我國臨床上有廣泛的應用，有活血化瘀，止痛等多種藥理作用。經研究，去甲漢黃芩不僅可以減少心肌缺血/再灌注損傷的梗死面積、改善心功能，還有其他重要作用，比如去除ROS并可降低白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達。而這些炎癥指標以及心功能等調整跟膿毒癥都密切相關[5-8]。然而，去甲漢黃芩素抗膿毒癥的作用機制和靶點仍不清楚。以網絡大數據為靶點的預測是通過計算方法將化合物及其作用的目標靶點和疾病靶點的信息結合起來，通過識別活性小分子的作用蛋白，來探索小分子對于疾病的作用靶點以及機制，這是加快新藥開發的一種方法[9]。因此，在本文中，利用網絡大數據，對靶點進行預測及驗證，進而分析和篩選去甲漢黃芩素抗膿毒癥的潛在靶點。

圖1 去甲漢黃芩素化學結構

1 材料

去甲漢黃芩素sdf格式文件，Swiss TargetPrediction服務器(http://www.swisstargetprediction.ch)，TCMSP數據庫(DRAR-CPI服務器(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)，分子對接服務器(http://systemsdock.unit.oist.jp)。

2 方法

2.1 藥理參數、分子特性評價與靶標預測 熟悉并掌握化合物的藥理參數和化合物的分子特性對加深該化合物的成藥性能的理解以及明確合適的藥物劑型具有重要的意義，隨之而來減輕了藥物研發前期大量的篩選工作負擔。利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)數據庫，評價去甲漢黃芩素體內過程的藥代動力學(ADME)[10]。

2.2 DRAR-CPI靶標預測 新藥開發的第一步是靶點預測，如何明確的篩選化合物的靶向蛋白藥是物開發的核心問題。DRAR-CPI服務器(https://cpi.bio-x.cn/drar)通過化學蛋白質相互作用分析來預測化學成分的靶向蛋白。先將參數設為默認值，然后將去甲漢黃芩素 (PubChem CID：5281674)的sdf文件上傳到DRAR-CPI服務器，最后篩選Z′-score<-0.5的靶向蛋白。

2.3 Swiss TargetPrediction靶標預測 使用Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)服務器，并在Marvin for JavaScript Version 6.1上參照PubChem數據庫上傳去甲漢黃芩素 (PubChem CID：5281674)的結構，繼而進行靶點篩選。

2.4 推測去甲漢黃芩素抗膿毒癥的靶標 以DRAR-CPI及Swiss TargetPrediction服務器預測到共有的去甲漢黃芩素 靶向蛋白作為潛在靶標信息同?倢?類孟德爾遺傳病數據庫(http://www.omim.org/)、毒性與基因?倱?較數據庫(https://ctdbase.org/)和藥物靶點數據庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)中有關膿毒癥部分的靶標與之相配，由此可以篩選出，既是膿毒癥的靶標蛋白又是去甲漢黃芩素的靶標蛋白，再將所得結果進行分析歸納。

2.5 分子對接 先向(https://www.dockingserver.com/web/docking)分子對接服務器中輸入“2.1”和“2.2”項下提及的有關蛋白PDB的 ID，再向服務器上傳甲漢黃芩素 的sdf文件，進行連接，并對結果進行分析。

3 結果與討論

3.1 藥理參數和分子特性評價 了解并掌握化合物的藥理參數和化合物的分子特性，就能夠加深對該化合物的成藥性能的理解，明確合適的藥物劑型，進而減少藥物研發前期大量的篩選操作[11]。其中口服去甲漢黃芩素的體內生物利用度(OB)是39.40%，比限量30%大，藥物相似度(DL)為0.21，比0.18大，可旋轉鍵數(RBN)為1，表明去甲漢黃芩素的口服吸收以及成藥性良好。藥物可以維持長時間的療效，其半衰期(HL)為16.93，半衰期較長，建議做成普通口服制劑。去甲漢黃芩素 ，分子量(MW)為270.25 Da，比500 Da小，油水分配系數為2.33，比5小，氫鍵供體為3和氫鍵受體為5，均接近5，與Lipinski′s[12]的5原則較為統一，說明成藥可能性較高。

3.2 靶標預測 靶標預測是新藥開發的第一步，如何明確篩選化合物的靶向蛋白已經成為藥物開發的核心問題[9]。這一目的通過分子反向預測靶標的計算釣靶方法已經逐漸被推廣開來。通過DRAR-CPI共篩選出392個靶標，在Swiss TargetPrediction服務器中進行篩選，獲得15個去甲漢黃芩素的相關靶點；結果中 Z′<-0.5的靶標共95個，(Z′<-0.5表明具有良好的靶向性)；再將Swiss TargetPrediction服務器和DRAR-CPI篩選到靶點合并，把重復靶點刪除，最后共得到105個靶點。

在人類孟德爾遺傳病數據庫(OMIM),毒性與基因比較數據庫(CTD)和藥物靶點數據庫(TTD)中輸入 “sepsis”，從毒性與基因比較數據庫(CTD)篩選到26個靶標蛋白，人類孟德爾遺傳病數據庫(OMIM)篩選到117個靶標蛋白，藥物靶點數據庫(TTD)篩選到21個蛋白，其中共有疾病靶標149個，把預測到的105個去甲漢黃芩素的靶標蛋白和疾病靶標匹配，結果發現既是分子靶標又是疾病靶標的蛋白有7個[即：絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、組織蛋白酶G(CTSG) 、蛋白C(PROC) 、凝血因子Ⅸ(F9)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、人雌激素受體β(ESR2) ]，具體篩選流程見圖2。

圖2 去甲漢黃芩素靶標鑒定流程圖

3.3 分子對接 在本實驗中可以發現，對去甲漢黃芩素和相關蛋白，基于使用dockingserver分子對接服務器，進行了分子對接。結果見表1，計算結果的自由結合能小于-5 kcal·mol-1的靶標有CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1，由計算結果可以得出去甲漢黃芩素具有結合這些靶標的能力[13]。

從圖3可以看出去甲漢黃芩素與ESR2的疏水相互作用殘基包括PHE356、MET336、LEU343、LEU301、ALA302、MET340、LEU476、THR299、ILE376、ILE373、ARG346以及GLU305。去甲漢黃芩素與PNP的疏水相互作用殘基包括SER220、ARG84、SER33、TYR88、HIS86、TYR192、PHE200、MET219、VAL217、ASN115以及GLU201。根據以上數據可以得出結論：去甲漢黃芩素可能會通過這些具有關鍵性的殘基與PNP和ESR2發生交互作用，從而才可以發揮藥物作用。

表1 去甲漢黃芩素與靶標蛋白相互作用分子對接數據如下表所示

膿毒癥及其引發的休克和多器官衰竭是成人重癥監護病房死亡的主要原因。雖然膿毒癥治療的外科方法和藥理學研究正在不斷改進，但流行病學研究表明，在過去20年中，膿毒癥的發生率明顯增加[14]。因此尋找有效的藥物一直是研究的熱點，本研究發現去甲漢黃芩素可能通過結合CTSG、ESR2、F9、PNP和MAPK1等蛋白起到抗膿毒癥作用。

膿毒癥發生時，凝血系統級聯反應會被激活，嚴重者會導致膿毒癥患者多器官功能衰竭甚至死亡[15-16]，而凝血因子F9參與凝血的內在途徑，跟膿毒癥密切相關[17]。研究表明膿毒癥大鼠下丘腦中樞的雌激素受體ESR2表達量降低，且炎癥介質與雌激素受體表達呈負相關，而大多數膿毒癥患者存在雌激素水平的紊亂，推測雌激素能緩解膿毒癥所導致的炎癥反應保護機體各個器官[18]。脂多糖(LPS)是引起膿毒癥的主要原因，能介導全身炎癥反應，炎性介質能激活不同MAPK以促進或抑制基因的轉錄，調控其他炎性介質的生成，MAPKI基因在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發揮重要作用。p38MAPK通路能夠調節炎癥進展，密切參與膿毒癥[19]，MAPK1是p38MAPK通路關鍵的信號物質，研究表明在膿毒癥大鼠中肺組織以及心肌組織的MAPK1表達均顯著升高，表明通過調節MAPK1能起到保護膿毒癥造成的肺組織及心肌組織的損傷[20-21]。CTSG作為一種絲氨酸類蛋白酶，可以水解活化前IL-1β以及TNF-α等細胞因子參與炎癥部位病原體清除、消化、吞噬和結締組織的重塑，在炎癥性疾病產生和發展過程中都發揮著重要的作用，而全身炎癥反應是膿毒癥的經典癥狀同時它還往往伴隨著急性肺損傷等[22]。嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)是嘌呤核苷酸磷解的必需酶，該酶的先天性缺陷會通過選擇性耗竭T細胞而導致嚴重的免疫缺陷綜合征，而膿毒癥的發生發展跟T細胞密切相關[23]。內源性活化PROC可以通過其抗炎作用來抑制膿毒癥凝血和抗炎反應，PROC可以通過抑制凝血酶的形成進而減輕炎癥反應，從而干擾脂多糖與胞膜上受體CD14的相互作用等。F9是一類具有絲氨酸蛋白酶活性的凝血因子。因此，去甲漢黃芩素可能通過與靶向蛋白PROC和F9結合，進而抑制凝血并減輕膿毒癥炎癥反應。

A.ESR2與去甲漢黃芩素分子對接圖；B.ESR2與去甲漢黃芩素的2D交互配圖；C.PNP與去甲漢黃芩素分子對接圖；D.PNP與去甲漢黃芩素的2D交互配圖圖3 去甲漢黃芩素與ESR2和PNP分子相互作用

綜上，去甲漢黃芩素能通過調節F9參與凝血系統級聯反應，通過調節ESR2維持雌激素水平的穩定，通過調節CTSG、MAPK1和PNP起到保護膿毒癥損傷器官的作用，最終通過緩解膿毒癥的癥狀及炎癥等水平起到抗膿毒癥作用。