甲磺酸去鐵胺促進大鼠顱骨臨界骨缺損血管化骨再生的早期連續觀察

杜文瑜，楊靜文，姜 婷

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，修復科 國家口腔醫學中心 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室，北京 100081)

血管化是骨骼生長和發育過程中的關鍵過程，探索骨缺損部位實現血管化和骨再生的基礎數據，在口腔頜面部缺損修復、口腔種植等臨床應用中具有一定的指導價值。

一般認為，骨缺損部位往往存在一過性缺氧等生理過程，因而具備了啟動血管化的條件，甲磺酸去鐵胺(deferoxamine mesylate,DFO)作為一種可促發血管化過程的缺氧模擬藥物逐漸受到關注。缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是細胞適應低氧環境的關鍵性轉錄因子，是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異二聚體蛋白質，HIF-1β亞基保持穩定，而HIF-1α亞基在常氧條件下很快被脯氨酰羥化酶(proline hydroxylase,PHD)結構域蛋白降解，在氧水平足夠低時，HIF-1α可以維持活性并積累，與HIF-1β結合，誘導下游基因表達[1]。DFO可以通過螯合鐵離子[2]對PHD起到抑制作用，從而在常氧環境下維持HIF-1α的活性。DFO在組織移植[3]、皮瓣轉移[4]、傷口愈合[5]、糖尿病創傷[6]、心肌缺血[7]等動物模型及臨床實驗中表現出了促進血管化的能力。

近年來，有學者探討了DFO在骨再生領域應用的可能，將DFO應用于骨缺損愈合模型，觀察到其在血管化和骨再生方面存在著促進效果[8]。然而，在DFO的干預下，骨缺損部位血管化及骨再生存在怎樣的變化，包括血管生成的數量如何隨時間變化，新生骨組織的量和礦化程度如何隨時間變化等問題尚不清楚。本研究旨在通過建立大鼠顱骨臨界骨缺損模型，連續觀察骨缺損愈合早期的血管生成情況和礦化組織形成情況，初步探索局部施用DFO對骨組織工程中血管化和骨再生的影響，并驗證DFO維持HIF-1α蛋白活性的能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、手術及分組

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級6～8周雄性SD大鼠購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，飼養于北京大學口腔醫院動物實驗室SPF級環境，適應性飼養1周后進行實驗。本研究經北京大學生物醫學倫理委員會批準(LA2017155)。

A critical size defect of skull was made and the periosteum was kept complete.圖1 SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型Figure 1 SD rats skull critical size defect model

構建30只SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型(圖1)。采用2%(體積分數)戊巴比妥鈉腹腔麻醉，備皮消毒后，沿大鼠顱頂縱向切開皮膚，分離皮下組織直達顱骨骨面，暴露手術區域，用直徑8 mm的去骨環鉆在顱骨上磨刻一圓形印記至顱骨即將穿透，用挖匙輕輕將圓形骨片與下方骨膜剝離，保持骨膜完整，不傷及深層組織，隨后分層縫合肌肉和皮膚，大鼠蘇醒后放回籠中繼續飼養，觀察大鼠狀態。

將30只大鼠隨機分為實驗組(DFO組)和對照組，每組15只，實驗組大鼠術后第4天于顱骨缺損處局部注射200 μmol/L的DFO溶液300 μL，對照組大鼠局部注射等量生理鹽水。兩組均分別于術后第5、7、10、14、28天采用二氧化碳過量麻醉法處死3只大鼠，取出顱骨術區標本，以10%(體積分數)中性甲醛溶液固定，逐步進行組織脫鈣、脫水、包埋及切片。

1.2 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

石蠟切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室溫下二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫蠟至水，蘇木素染核5 min后，流水輕柔沖洗2～3 min，用1%(體積分數)鹽酸乙醇溶液分化1 s，洗去浮色，氨水返藍1 min，流水輕柔沖洗10 min，伊紅染色1 min，梯度乙醇溶液脫色及脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。

切片均使用Olympus BX51專業數碼成像裝置及配套專業軟件，在40倍、100倍放大條件下觀察并拍照(4 140×3 096像素)，組織學觀察HE染色切片骨缺損處新生組織和骨斷端結合情況。

1.3 Masson骨膠原染色及計量

石蠟切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室溫下二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫蠟至水，蒸餾水潤濕玻片1 min后，使用Masson染色試劑盒內的核染液染核1 min，棄去，沖洗液沖洗30 s，漿染液染色30～60 s，棄去，沖洗液沖洗30 s，分色液作用6～8 min，棄去，復染液染色5 min，棄去，用無水乙醇沖洗，二甲苯透明后，用中性樹膠封片。

切片均使用Olympus BX51專業數碼成像裝置及配套專業軟件，在40倍、100倍放大條件下觀察并拍照(4 140×3 096像素)。組織學觀察Masson染色切片骨缺損處新生組織內部骨膠原分布情況及新生骨組織礦化程度。

對新生骨組織礦化程度使用礦化組織面積(新生骨組織中紅染部分)占新生骨組織(紅染及藍染部分)面積的百分比進行定量測量[9]。圖像處理主要使用Image J(版本1.52K)軟件，對拍攝的100倍放大圖片中的舊骨、軟組織等非新生骨組織區域進行遮罩剔除后，測算總面積計為a，將彩色畫幅轉化為灰度8位深度圖，取閾值區間(225，255)為白色背景區域，計算面積為b，將彩色畫幅轉化為RGB(紅綠藍通道)畫幅，對紅色通道(R)取閾值區間(123，255)為紅色和白色的合并區域，計算面積為c。面積計算采用Analyse模塊中的Analyse Particles函數計算面積區域，其中，面積閾值為1 μm2至無限大，基于此可計算出：(1)高度鈣化的新生骨面積，即圖中紅染區域面積為c-b；(2)低度鈣化或未鈣化的新生骨面積，即藍染面積為a-c；(3)高度鈣化占新生骨的比例為(c-b)/(a-b)×100%。

1.4 免疫組織化學染色及計量

石蠟切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室溫下二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫蠟至水，PBS洗片，3%(體積分數)H2O2室溫避光孵育30 min，阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS洗片，采用酶修復法修復抗原，0.5%(體積分數)胰酶溶液與胰酶稀釋液以體積比1 ∶3均勻混合滴加于組織切片上，37 ℃孵育10 min，PBS洗片，將一抗抗體用抗體稀釋液以一定比例稀釋，將載玻片置于裝有蒸餾水的濕盒中，在樣本上滴加稀釋好的一抗，將濕盒置于4 ℃冰箱過夜孵育。使用CD31一抗抗體標記血管內皮細胞，使用HIF-1α一抗抗體標記HIF-1α蛋白。PBS洗片，向組織上滴加辣根或氫氧化物酶標記的二抗，均勻覆蓋全部組織，避光室溫孵育30～40 min，DAB顯色1～5 min，顯微鏡下觀察控制染色時間，自來水洗，復染，脫水，二甲苯透明后，用中性樹膠封片。

組織切片使用Olympus BX51專業數碼成像裝置拍照。使用Image J軟件測量HIF-1α標記的放大200倍的組織切片陽性染色的平均光密度值(average optical density，AOD)，即積分光密度值/測量面積(integrated optical density，IOD/Area)。實驗組AOD值參照對照組AOD值的平均值進行標準化處理，即求倍數關系，計為HIF-1α的相對表達量，此時對照組表達量為1。對使用CD31標記血管的放大200倍的組織切片照片計數新生血管數量并進行數據分析。與HE染色切片相比，免疫組織化學染色對于血管計數的敏感性更高，其可清晰識別出僅由2～3個內皮細胞圍成的血管樣組織，因而可以觀察到內皮細胞的遷移聚集、增殖及其血管化等多個階段。

1.5 統計學分析

使用統計分析軟件SPSS 22.0對同一時間點兩組間的HIF-1α蛋白相對表達量、血管數量、礦化程度進行t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DFO促進骨缺損區域血管化

圖2為免疫組織化學染色，結果顯示骨缺損術后第5天，可觀察到骨斷端周圍軟組織內散在的內皮細胞分布，少量微小血管形態已經形成，管徑普遍較小，新生血管尚未成熟，實驗組缺損間隙內的血管分布比對照組更為密集；術后第7天，兩組缺損處可見血管樣組織，或為截面直徑較小的圓環形，或為順應纖維組織形態的扁長形，血管壁結構較單一；術后第10天，實驗組明顯可見內皮細胞環繞形成的血管管腔結構，管徑較前增大，部分管腔橫截面內可見血細胞分布，新生骨樣組織內可見新生血管長入，對照組的血管數量及發生形態均落后于實驗組；術后第14天，實驗組可見新生血管出現較為完整的管壁內皮細胞環繞，血管形態出現分枝狀，管徑明顯增大，對照組的血管數量及成熟度遠低于實驗組，同時還發現同一組內從術后第10天至第14天血管數量有減少趨勢；術后第28天，實驗組可見血管分布較為密集，形態趨于成熟，管徑增大，管腔內血細胞分布較多，同時仍可見未成熟新生血管仍在發生，對照組血管分布密度及血管發育成熟程度低于實驗組。

Yellow arrow indicates the examples of vascular tissue,“B”marks the defect border or the edge of new bone.DFO,deferoxamine mesylate.圖2 CD31標記的血管免疫組織化學染色圖像(n=3)Figure 2 Immunohistochemistry staining images of the vessels marker CD31(n=3)

術后血管計數結果也印證了上述發現，術后第5、7、10、14、28天的各個時間節點，實驗組新生血管的數量均高于對照組，各時點的兩組間差異均有統計學意義(表1)。

2.2 DFO促進骨缺損區域的骨再生及礦化

HE染色(圖3A)結果顯示，骨缺損術后第5天及第7天，實驗組及對照組均可見清晰銳利的骨缺損邊界；術后第10天，實驗組可見新生骨樣組織自缺損邊緣向缺損中心方向延伸，并可見骨陷窩及骨細胞，對照組也可見少量新生骨樣組織出現；術后第14天，實驗組可見成骨區開始改建出現骨髓腔樣組織，其新生骨樣組織面積多于對照組；術后第28天，實驗組新生骨量多于對照組，兩組均可見較為成熟的礦化骨組織。Masson骨膠原染色(圖3B)結果顯示，術后第14天，兩組均可見紅染的舊骨斷端周圍出現藍染的新生骨組織，其間可見紅染的礦化程度較高的骨組織呈點狀或條狀分布；術后第28天，實驗組的新生骨量及紅染礦化組織面積明顯多于對照組，使用礦化組織面積(新生骨組織中紅染部分)占新生骨組織(紅染及藍染部分)面積的百分比對新生骨組織礦化程度進行測量和計算，結果見表2。

New bone is circulated by yellow and marked with“NB”.DFO,deferoxamine mesylate.圖3 骨缺損區域HE染色(A)及Masson骨膠原染色(B)圖像(n=3)Figure 3 HE staining(A)and Masson staining(B)images of the bone defect area(n=3)

表2 實驗組和對照組礦化程度的測量Table 2 Measuring of percentages of mineralized tissue area

2.3 DFO短暫維持HIF-1α活性

免疫組織化學染色(圖4)結果顯示，各組骨缺損區域愈合組織中均可見少量HIF-1α蛋白陽性表達。分析各組HIF-1α蛋白AOD值的相對表達量顯示，術后第5天，即局部給予DFO后1天，實驗組HIF-1α蛋白的相對表達量顯著高于對照組，術后第7、10、14、28天，實驗組HIF-1α蛋白的相對表達量略高于對照組，但組間差異無統計學意義(表3)，提示術后第4天局部給予DFO僅可短暫維持HIF-1α活性。

表3 HIF-1α蛋白的相對表達量(倍數)Table 3 Relative expression of HIF-1α(fold change)

Examples of HIF-1α protein expression positively stained in brown is indicated with yellow arrow.DFO,deferoxamine mesylate;HIF-1α,hypoxia inducible factor 1α.圖4 HIF-1α蛋白表達(DAB ×200，n=3)Figure 4 Expression of HIF-1α(DAB ×200,n=3)

3 討論

一般認為，高含量的氧供給和活躍的新陳代謝是新骨生成的必要條件，組織長期處于缺氧狀態會出現不愈合或壞死狀態，然而，一定程度的缺氧刺激，又能促進血管生成，從而加速骨愈合。目前為止，如何獲得可以促進骨缺損愈合的特定缺氧環境尚不清楚，對能發揮缺氧刺激促進作用而又不影響組織新陳代謝的平衡點的相關研究十分重要。近年來，使用缺氧模擬藥物(如DFO)在常氧條件下維持HIF活性而不降低組織氧濃度，創造“假性缺氧環境”[10-11]，在骨缺損愈合中的應用研究逐漸受到關注[8,12-13]。本研究探索了局部注射DFO對動物骨缺損模型中血管化和成骨的促進作用。

自然條件下，骨缺損愈合一般遵循以下關鍵時間點：缺損后約第3天，缺損區域可有纖維細胞和早期血管生成細胞長入[14]；約第5～7天，骨內、外膜增生，新生血管長入；約第10天，軟骨開始形成；約第14天，骨折端附近形成的骨樣組織逐漸鈣化成骨；之后進入骨改建重塑期[15]。新骨生成的早期是血管生成的關鍵時期，因而本研究選擇在缺損處血管增生時期，即缺損術后第4天給予200 μmol/L[12,16]DFO刺激，同時，選擇關鍵時間點，即術后第5、7、10、14天和骨組織再生及重塑后的第28天，觀察DFO組和生理鹽水對照組的差異。各時間點之間的差異反映了施用缺氧模擬藥物后對血管生成及骨缺損愈合進程和效果的影響差別。

組織學觀察發現，相同時間點實驗組的血管數量和血管組織的形態成熟度均明顯優于對照組，提示在SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型中應用DFO可產生促進血管新生的效果。內皮細胞遷移、增殖和血管化過程由血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介導[17]，而實現VEGF上調則與HIF的維持關系密切[1]。自然愈合過程中，缺損導致的血腫及炎癥造成的局部缺氧環境可能會促進HIF表達，然而，HIF-1α并不穩定，失活較快，對VEGF的上調作用有限，應用DFO則可維持HIF-1α活性，實現對缺氧環境的延長與增效，為上調VEGF表達提供更長的窗口。

DFO組在骨組織再生方面明顯優于對照組，提示局部使用DFO不僅加速了成骨過程，相同時間內的成骨強度即礦化程度也得到了優化。DFO對成骨的促進可能來自兩個途徑：首先，血管化為骨再生提供了重要的物質保障，新生血管不僅供應成骨所需的營養物質，還可遞送駐留在血管壁內的干細胞和成骨前體細胞[18]。本研究結果也證實，血管樣組織在新生骨結構附近比較集中，充分的營養供應保證了成骨所需良好的微環境，有利于成骨細胞的分化、增生和成熟。其次，血管內皮細胞可通過表達成骨刺激因子為骨組織再生提供刺激及分化可能[19]。骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是成骨微環境中的重要信號蛋白，而低氧環境可刺激血管內皮細胞上調BMP-2的表達[20]。此外，BMP-2上調過程中，缺氧的角色，比如缺氧是否為單純觸發條件，或者是BMP-2上調的持續性必要條件，以及DFO能否起到促進內皮細胞上調表達BMP-2的作用，尚值得深入研究。

本研究通過組織學實驗驗證了DFO維持HIF-1α活性的作用。僅在SD大鼠顱骨缺損術后第5天，也即給藥1天后處死的大鼠組織缺損區域，DFO組HIF-1α的表達顯著高于對照組，提示DFO維持HIF-1α活性的作用時間較為短暫。結合HIF-1α在血管及新生骨組織生成中發揮的促進作用，若通過增加DFO注射頻次可以達到持續延長HIF-1α活性的效果，將有可能延長促進血管化及骨再生的作用。

本研究通過建立SD大鼠顱骨臨界骨缺損模型，選用較為安全、微創、可操作性強的局部注射方式給予DFO，觀察其對骨缺損愈合早期血管化和骨再生過程的影響，結果顯示，早期給予DFO局部注射可增加骨缺損組織愈合中新生血管數量和新生骨組織的量和礦化程度，但如何明確DFO的使用方法以獲得骨缺損愈合的最佳缺氧環境尚需進一步研究。本研究也存在局限性，如實驗動物樣本量較少，可能會存在一定程度上的個體差異影響。本研究初步探討了DFO對骨缺損區域血管化和骨再生的促進作用，今后的研究中將進一步擴大樣本量，可以通過調整DFO使用濃度、給藥時間點、給藥次數，嘗試開發DFO的最優施用方式。本研究結果提示，在骨缺損局部施用DFO可促進缺損愈合，可能具有一定的臨床應用價值。