吳茱萸堿對HepG2細胞毒性及其機制

高亞東，朱 安，李璐迪，張 濤，王 碩，單丹萍，李盈姿，王 旗,2,3,△

(1.北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系，北京 100191；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點研究室，北京 100191；3.食品安全毒理學研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191)

吳茱萸(Evodiaefructus)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的功效。吳茱萸有小毒[1]，臨床上常因服用生品吳茱萸、未制透的吳茱萸或超劑量服用而中毒，研究表明肝臟是吳茱萸的主要毒性靶器官[2-3]，但尚未闡明其毒性物質基礎及毒性機制。吳茱萸堿(evodiamine，EVO)屬色胺吲哚類生物堿，是吳茱萸主要生物堿成分之一，具有抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抑菌[6]、鎮(zhèn)痛[7]、神經(jīng)保護[8]等藥理作用。EVO可能是吳茱萸肝毒性的物質基礎，其可降低人正常肝細胞L-02存活率，升高谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate amino-transferase，AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性[9]，但其肝毒性機制尚不明確。動物實驗發(fā)現(xiàn)吳茱萸肝毒性機制與氧化損傷相關[10]，可導致ALP活性和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)含量升高[3]，并促使肝細胞凋亡[11]。HepG2細胞具有許多肝臟特異性相關功能，是目前用于評估肝毒性的人源細胞模型之一，廣泛應用于藥物肝毒性及分子機制研究[12]，因此，本研究用HepG2細胞研究EVO的肝細胞毒性作用特點，從脂質過氧化損傷、凋亡和膽汁淤積三方面初步探討其毒性機制。

1 資料與方法

1.1 細胞系

HepG2細胞由北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系趙鵬老師惠贈。

1.2 藥物及主要試劑

EVO由北京大學藥學院天然藥物學系楊秀偉教授提供，純度≥98%。細胞增殖及毒性檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒和異硫氰酸熒光素標記的膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，ALT、AST、LDH、ALP和TBIL檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，線粒體膜電位熒光探針(superior alternative to JC-1，JC-10)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，小鼠抗人β-actin抗體(TA-09)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-5301)和辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人caspase-9(ab25758)、caspase-3(ab32351)、膽鹽輸出泵(bile salt export pump，BSEP，ab155421)和多耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2，ab172630)抗體購自英國Abcam公司。

1.3 主要儀器

HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo Sscientific公司，F(xiàn)LUOstar Omega多功能酶標儀購自德國BMG公司，CytoFLEX流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，Mini-PROTEAN Tetra Cell小垂直板電泳轉印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞培養(yǎng)在有10%(體積分數(shù))胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)中，置于37 ℃、95%濕度、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱，2～3 d傳代一次。

1.4.2CCK-8法檢測細胞存活率 將對數(shù)生長期的HepG2細胞(1×105/mL)接種于96孔板，每孔100 μL。24 h細胞貼壁后棄上清液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌一次，加入含EVO(0、0.04、0.2、1、5和25 μmol/L)無血清培養(yǎng)基，分別處理24、48和72 h，0 μmol/L組作為對照組，其他劑量組作為EVO實驗組。處理結束后向每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃水浴30 min，用多功能酶標儀測定450 nm處光密度值，計算細胞存活率和半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.4.3細胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量檢測 將對數(shù)生長期的HepG2細胞(2×105/mL)接種于24孔板，每孔0.5 mL。24 h細胞貼壁后棄上清液，PBS洗滌一次，加入含EVO(0、0.2、1和5 μmol/L)無血清培養(yǎng)基處理48 h。吸取細胞培養(yǎng)液，600×g離心5 min取上清液，按照ALT、AST、LDH、ALP和TBIL試劑盒說明書進行操作，用多功能酶標儀分別檢測相應的光密度值，計算ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量。

1.4.4SOD活性和MDA含量檢測 將對數(shù)生長期的HepG2細胞(2×105/mL)接種于6孔板，每孔2 mL。EVO處理HepG2細胞方法同第1.4.3小節(jié)。用裂解液裂解細胞后，于4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清液并用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid assay，BCA)測定其總蛋白濃度，按照SOD和MDA試劑盒說明書分別測定SOD活性和MDA含量。

1.4.5分子對接 用SYBYL-X 2.0軟件，將EVO與凋亡相關蛋白caspase-9和caspase-3、自噬相關蛋白選擇性自噬接頭蛋白(sequestosome-1，SQSTM1/p62)、Beclin-1和微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain-3，LC3)和鐵死亡相關蛋白谷胱甘肽過氧化酶4(glutathione peroxidase 4，Gpx4)進行分子對接。蛋白質三維結構從蛋白質數(shù)據(jù)庫(protein data bank，PDB)獲取。對接前先對蛋白進行處理，獲得能量最小化的穩(wěn)定結構。對EVO進行能量最小化計算。選擇高精度模式，提取配體分子，生成蛋白結合活性口袋，進行半柔性分子對接[13]。對接結果采用總得分值進行評價，總得分值大于5即認為EVO可與靶蛋白結合，且得分越高代表結合越強。采用PyMOL2.7 和LigPLOT軟件將EVO與靶蛋白對接結果進行可視化。

1.4.6線粒體膜電位檢測 HepG2細胞培養(yǎng)以及EVO處理細胞方法同第1.4.4小節(jié)。胰酶消化后收集細胞，加入JC-10染色工作液，置于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃避光孵育20 min，用JC-10染色緩沖液(1×)洗滌2次，經(jīng)300目細胞篩制成單細胞懸液，流式細胞儀檢測紅、綠熒光強度，計算紅、綠熒光相對比例。

1.4.7Annexin V-FITC/PI探針檢測細胞凋亡 HepG2細胞培養(yǎng)以及EVO處理細胞方法同第1.4.4小節(jié)。收集細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，用不含Ca2+、Mg2+的乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)胰酶消化后收集細胞，800×g離心5 min，棄上清液，PBS重懸細胞并計數(shù)。取(5～10)×104細胞，600×g離心5 min后棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，再分別加入0.2 μL Annexin V-FITC和2.5 μL PI染色液，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀檢測Annexin V-FITC的綠色熒光和PI的紅色熒光，計算細胞凋亡率。

1.4.8Western blot檢測凋亡蛋白及膽汁酸轉運體蛋白表達量 將對數(shù)生長期的3.5×106個HepG2細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，EVO處理細胞方法同第1.4.4小節(jié)。提取總蛋白，并用BCA法測定其濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后，沸水浴7 min使蛋白變性。20 μg等量蛋白上樣，40 mA、100 min進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，隨后使用聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)印跡膜300 mA電轉90 min，6%(質量分數(shù))脫脂奶粉溶液封閉2 h，含吐溫20的Tris緩沖鹽溶液(tris-buffered saline with tween-20，TBST)清洗三次，每次10 min，4 ℃孵育一抗過夜。TBST清洗三次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h。TBST清洗三次，每次10 min，加極超敏化學發(fā)光試劑曝光成像。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 EVO對HepG2細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組相比，EVO實驗組HepG2細胞存活率均降低，且呈劑量和時間依賴性，其中0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細胞24 h，細胞存活率分別為87.3%、81.1%和73.3%；處理48 h，細胞存活率分別為84.3%、63.1%和55.8%；處理72 h，細胞存活率分別為62.7%，55.1%和52.9%。EVO處理HepG2細胞24、48和72 h的IC50分別為85.3、6.6和4.7 μmol/L。

n=3.# P<0.01,compared with control group at the same time.EVO,evodiamine.圖1 不同濃度和時間下的EVO對HepG2細胞存活率的影響Figure 1 Effects of EVO on viability of HepG2 cells at different concentrations and time

基于EVO處理HepG2細胞的IC50，考慮吳茱萸藥材中EVO含量和人體攝入量，選擇0.2、1、5 μmol/L為EVO低、中、高劑量處理細胞48 h作為后續(xù)實驗條件。

2.2 EVO對HepG2細胞肝功能生化指標的影響

如表1所示，與對照組相比，不同濃度EVO處理HepG2細胞48 h后，細胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH、ALP活性和TBIL含量均不同程度升高，且ALT、AST和ALP升高在5 μmol/L EVO組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，LDH升高在0.2、1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，TBIL升高在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 EVO處理HepG2細胞48 h對肝功能生化指標的影響Table 1 Effects of EVO on biochemical indicators in HepG2 cells for 48 n=3)

2.3 EVO對SOD活性和MDA含量的影響

如圖2所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細胞48 h后，SOD酶活性從對照組的32.17 U/mg蛋白分別降低至30.96、24.95和24.47 U/mg蛋白，且在1和5 μmol/L EVO組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MDA含量從對照組的1.91 μmol/g蛋白分別升高至2.34、2.83和3.45 μmol/g蛋白，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。上述結果表明，EVO可導致HepG2細胞脂質過氧化損傷。

A,SOD activity;B,MDA content. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48h.# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine;SOD,superoxide dismutase;MDA,malondialdehyde.圖2 EVO對HepG2細胞脂質過氧化損傷的影響Figure 2 Effects of EVO on lipid peroxidation damage in HepG2 cells

2.4 EVO與凋亡、自噬和鐵死亡相關蛋白的對接

如表2和圖3所示，EVO可與凋亡相關蛋白caspase-9和caspase-3直接結合，總得分值均高于5，結合力主要是氫鍵，此外還有弱相互作用參與。與自噬相關蛋白p62、Beclin-1和LC3，以及鐵死亡相關蛋白Gpx4無法結合，總得分值均低于5，提示EVO的肝細胞毒性作用可能涉及細胞凋亡。

表2 EVO與凋亡、自噬和鐵死亡相關蛋白對接Table 2 Molecular interactions between EVO and apoptosis,autophagy or ferroptosis-associated proteins

A,the 3D model of caspase-9;B,the 2D model of caspase-9;C,the 3D model of caspase-3;D,the 2D model of caspase-3.EVO,evodiamine.圖3 EVO與人源凋亡相關蛋白相互作用Figure 3 Molecular interaction between EVO and human apoptosis-associated proteins

2.5 EVO對HepG2細胞線粒體膜電位的影響

如圖4所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細胞48 h后，與對照組(87.2%)比較，紅、綠熒光相對比例分別降低至 71.9%，63.7%和72.6%，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明EVO可導致HepG2細胞線粒體膜電位的下降。

n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine.圖4 EVO對HepG2細胞線粒體膜電位的影響Figure 4 Effects of EVO on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells

2.6 EVO對HepG2細胞凋亡的影響

如圖5所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細胞48 h后，與對照組(4.9%)比較，細胞凋亡比例分別升高至6.8%、8.0%和11.3%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A,apoptosis was evaluated by Annexin V-FITC and PI staining;B,quantitative statistical results of the proportion of apoptotic n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48h.# P<0.01 compared with control group.FITC,fluorescein isothiocyanate;PI,propidium iodide;EVO,evodiamine.圖5 EVO對HepG2細胞凋亡率的影響Figure 5 Effects of EVO on apoptosis rate in HepG2 cells

2.7 EVO對HepG2細胞凋亡相關蛋白的影響

如圖6所示，EVO處理HepG2細胞48 h后，0.2、1和5 μmol/L EVO組的caspase-9剪切蛋白表達量分別為對照組的1.1、1.2和1.8倍，caspase-3剪切蛋白表達量分別為對照組的1.3、1.5和2.2倍，在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，caspase-3前體蛋白表達量分別為對照組的87.2%、78.0%和50.4%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，上述結果表明EVO可引發(fā)HepG2細胞凋亡。

A,relative protein expression levels by Western blot;B,semi-quantitative analysis. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.* P<0.05,# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine.圖6 EVO對HepG2細胞caspase-9和caspase-3蛋白表達的影響Figure 6 Effects of EVO on the protein expressions of caspase-9 and caspase-3 in HepG2 cells

2.8 EVO對BSEP和MRP2蛋白表達的影響

BSEP和MRP2是重要的膽汁酸轉運體，如圖7所示，0.2、1和5 μmol/L EVO處理HepG2細胞48 h后，BSEP蛋白表達量分別為對照組的94.0%、84.8%和61.8%，MRP2蛋白表達量分別為對照組的91.2%、63.5%和51.1%，在1和5 μmol/L EVO組差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明EVO可抑制HepG2細胞膽汁酸轉運體BSEP和MRP2，使膽汁酸外排受阻從而導致膽汁淤積的發(fā)生。

A,relative protein expression levels by Western blot;B,semi-quantitative analysis. n=3.HepG2 cells were treated with EVO for 48 h.* P<0.05,# P<0.01,compared with control group.EVO,evodiamine;BSEP,bile salt export pump;MRP2,multidrug resistance-associated protein 2.圖7 EVO對HepG2細胞BSEP和MRP2蛋白表達的影響Figure 7 Effects of EVO on the protein expressions of BSEP and MRP2 in HepG2 cells

3 討論

EVO是吳茱萸重要的藥理活性成分，也可能是其潛在的肝毒性成分。李文蘭等[14]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜發(fā)現(xiàn)EVO是吳茱萸肝毒性部位化學成分及入血成分之一，且EVO可降低L-02細胞存活率，升高ALT、AST、LDH和ALP活性[9]，因而推測EVO可能是吳茱萸肝毒性的物質基礎。

藥物引起的肝損傷是多因素作用的結果，主要涉及脂質過氧化損傷、膽汁淤積、線粒體功能失調、免疫損傷、信號轉導，以及凋亡、壞死和自噬等肝細胞死亡機制。動物實驗研究表明，吳茱萸水提組分肝毒性機制與氧化損傷有關[10]，可引起ALP和TBIL升高[3]，促使肝細胞凋亡[11]。本研究中分子對接結果顯示EVO可與凋亡相關蛋白結合，因而我們從脂質過氧化損傷、細胞凋亡和膽汁淤積方面探究EVO的肝細胞損傷機制。

本研究中，CCK-8實驗結果顯示EVO可降低HepG2細胞存活率，且呈時間和劑量依賴性。ALT主要存在于肝細胞中，具有較好的組織特異性，AST存在于肝臟、腎臟、心臟和骨骼肌中，當肝細胞受損導致細胞膜通透性增加時，ALT和AST會被釋放出來，使血清或肝細胞培養(yǎng)液中的酶活力增高，通常結合這兩種酶來判斷肝損傷情況。LDH是細胞質內穩(wěn)定表達的酶，可以通過測定釋放出的LDH活性評價細胞膜的完整性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，EVO處理HepG2細胞48 h可顯著升高上清液中ALT、AST和LDH活性，提示EVO可破壞細胞膜完整性，導致ALT和AST釋放增加，對肝細胞具有損傷作用。

某些藥物可導致肝細胞內活性氧堆積和氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡失調，引發(fā)氧化應激狀態(tài)，從而激起自由基的連鎖增殖反應，與膜磷脂的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，產(chǎn)生脂質過氧化損傷。SOD是清除超氧自由基的關鍵抗氧化酶[16]，在氧化應激時，其活性降低。MDA是脂質過氧化的主要分解產(chǎn)物，通常作為多不飽和脂肪酸過氧化的經(jīng)典標志物[17]。本研究中，EVO可以降低HepG2細胞SOD活性，升高MDA含量，說明細胞內的氧化/抗氧化平衡被打破，EVO可導致HepG2細胞的脂質過氧化損傷。

分子對接解析了EVO與凋亡相關蛋白caspase-9、caspase-3，自噬相關蛋白p62、Beclin-1、LC3和鐵死亡相關蛋白Gpx4的結合情況，結果表明EVO可結合凋亡相關蛋白，但無法與自噬和鐵死亡相關蛋白結合，提示EVO所致HepG2細胞毒性作用機制可能涉及細胞凋亡，而與細胞自噬和鐵死亡關系不大。

MMP下降作為凋亡的早期指征，是評價線粒體功能的敏感指標。MMP下降可促使線粒體通透性轉換孔開放，使細胞色素C從線粒體釋放至胞漿，與凋亡蛋白酶活化因子-1結合為多聚體，活化caspase-9前體并進一步激活凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，導致細胞凋亡[18]。本研究通過JC-10熒光探針染色檢測到MMP下降，采用Annexin V-FITC/PI熒光探針染色檢測到細胞凋亡率升高，表明EVO可誘導HepG2細胞凋亡。通過Western blot檢測凋亡相關蛋白caspase-9和caspase-3的表達水平，發(fā)現(xiàn)EVO可下調caspase-3前體蛋白表達，并上調caspase-9和caspase-3剪切蛋白表達。以上結果表明細胞凋亡介導了EVO所致的HepG2細胞毒性。

膽汁淤積性肝損傷是藥物性肝損傷中的重要類型。肝細胞至腸道的膽汁轉運受阻時，可導致膽汁酸在肝臟中蓄積，引發(fā)肝細胞線粒體損傷、氧化應激和細胞死亡[19]。ALP主要經(jīng)膽汁代謝，當藥物引起肝損傷時，膽汁排泄受阻，可引起血清ALP升高，而當肝損傷引起膽紅素代謝降低時，可引起血中TBIL的濃度升高，因而ALP和TBIL是反映膽汁淤積型肝損傷的重要標志物。EVO處理HepG2細胞48 h可致ALP活性和TBIL含量升高，提示EVO可能引起膽汁淤積性肝損傷。BSEP和MRP2位于肝細胞膽管側膜上，是介導游離或結合型膽汁酸外排的重要轉運體[20]，其中BSEP是關鍵的膽汁酸轉運體，已有多種藥物因抑制BSEP功能誘發(fā)肝毒性從而導致黑框警告或撤市[21-22]。歐洲藥品管理局和國際運輸聯(lián)盟已建議在臨床前或臨床研究過程中需對藥物是否抑制BSEP進行評估[23]，可見評估對BSEP的抑制作用對預測藥物是否誘導膽汁淤積型肝損傷具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)EVO顯著降低HepG2細胞中BSEP和MRP2蛋白表達水平，提示EVO可抑制HepG2細胞BSEP和MRP2轉運體表達，使肝細胞內膽汁酸濃度升高，產(chǎn)生膽汁淤積性肝損傷。

綜上所述，本研究表明EVO可導致HepG2細胞毒性，其肝細胞毒性機制涉及脂質過氧化損傷、細胞凋亡和膽汁淤積。