Cyp4v3基因敲除小鼠模型的表型分析

賈睿璇，姜尚偉，趙 琳，楊麗萍

(北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科，眼部神經(jīng)損傷的重建保護(hù)與康復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191)

結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性(Bietti crystalline dystrophy，BCD)是一種相對罕見的視網(wǎng)膜變性，典型改變?yōu)辄S白色閃光結(jié)晶樣物質(zhì)沉積于視網(wǎng)膜，并伴有視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細(xì)胞和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層萎縮，部分患者角膜緣也可見黃白色結(jié)晶沉積[1]。該病是一種常染色體隱性遺傳病，由Bietti[2]醫(yī)生在1937年描述。BCD在世界范圍內(nèi)是一種罕見的遺傳病，在東亞人群中發(fā)病率較高，尤其是在中國和日本[3-5]。

臨床上，絕大多數(shù)BCD患者20～40歲發(fā)病，雙眼受累。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性中心視力下降，或夜盲，或兩者兼有，亦有無自覺癥狀，因眼底檢查才被發(fā)現(xiàn)者。色覺早期正常，晚期可有紅綠色盲或全色盲。通常在患者50～60歲時(shí)由于嚴(yán)重的視力下降和視野縮小成為法定盲人[6]。眼部檢查發(fā)現(xiàn)，BCD患者的特征性表現(xiàn)為眼底有大量黃白色結(jié)晶沉積，主要位于視網(wǎng)膜后極部，伴不同程度的色素沉積，但在晚期患者中結(jié)晶沉積減少甚至不明顯[3,7-9]。光學(xué)相干成像(optical coherence tomography，OCT)檢查顯示RPE和脈絡(luò)膜可呈現(xiàn)出高反射性[10-12]。眼底熒光血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)檢查顯示RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮[13]。視網(wǎng)膜電生理(electroretinogram，ERG)檢查早期可表現(xiàn)為輕中度異常，甚至可無異常，但在晚期ERG波幅下降甚至記錄不到波形[10,14-15]。

2004年，Li等[16]確定BCD的致病基因?yàn)镃YP4V2基因，隨后不斷有新的CYP4V2突變位點(diǎn)被報(bào)道，進(jìn)一步擴(kuò)大了CYP4V2的致病突變譜[3-4,17-20]。CYP4V2基因位于4q35，共包含11個(gè)外顯子，基因組全長19 kb，編碼525個(gè)氨基酸。其編碼的蛋白屬于細(xì)胞色素P450家族成員，廣泛表達(dá)于人體的多個(gè)組織器官，包括肝臟、角膜、視網(wǎng)膜、淋巴細(xì)胞等，在脂肪酸代謝中發(fā)揮重要作用。有研究顯示BCD患者血清中脂肪酸含量異常，推測其與CYP4V2蛋白所具有的催化中長鏈脂肪酸羥化反應(yīng)有關(guān)[21-24]。在中國患者中，三個(gè)已知突變位點(diǎn)c.802-8_810del17bp、c.1091-2A>G和c.992A>C出現(xiàn)的頻率最高，共占73.5%，是中國漢族BCD患者的突變熱點(diǎn)，其中c.802-8_810del17bp突變導(dǎo)致mRNA水平外顯子7缺失，進(jìn)而突變后的mRNA以無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途徑降解，其發(fā)病機(jī)制為蛋白功能缺失，基因替代治療通過外源途徑補(bǔ)充缺失蛋白的功能，理論上可有效控制患者病情。CYP4V2蛋白結(jié)構(gòu)在不同物種間具有高度保守性，小鼠CYP4V3蛋白與人類具有高達(dá)92%的相似度，因此，為更好地了解BCD發(fā)病機(jī)制，本研究建立了Cyp4v3基因敲除小鼠模型，以模擬BCD患者的癥狀，并加以研究。我們通過眼底彩照檢查觀察Cyp4v3-/-小鼠眼底是否存在結(jié)晶沉積，ERG檢查小鼠視網(wǎng)膜功能是否改變，免疫熒光染色觀察小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，鬼筆環(huán)肽染色觀察小鼠RPE形態(tài)結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，以觀察該小鼠模型是否可模擬患者BCD臨床改變，為后續(xù)發(fā)病機(jī)制和基因治療研究提供有效動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)6～8周C57BL/6J野生型(wild type,WT)小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，Cyp4v3-/-小鼠委托北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。以上小鼠均飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室中。

1.2 主要試劑和儀器

超微量分光光度計(jì)(ND2000)購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，PCR擴(kuò)增儀(EDC810,ETC 811)購自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，測序儀(3130XL)購自美國ABI公司，小動(dòng)物視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)(Micro III)購自美國Phoenix Research Laboratory 公司，視覺電生理儀(Espion E2)購自美國Diagnosis 公司，眼科手術(shù)顯微鏡購自美國Alcon公司，冰凍切片機(jī)(CM3050)購自德國Leica公司，激光共聚焦顯微鏡(A+/AIR+)購自日本NICON 公司，熒光顯微鏡(Leica)購自德國 Leica 公司。血液基因組 DNA 抽提試劑盒(D3392-02)購自美國 OMEGA 公司，2×Taq Master Mix(Dye Plus，P112-01)購自南京諾唯贊生物科技有限公司，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))阿托品購自美國Alcon公司，2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))羥甲基纖維素購自天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司，三溴乙醇購自美國Sigma公司，抗視紫紅質(zhì)抗體(anti-rhodopsin antibody，1D4，ab5417)購自美國Abcam 公司，花生凝集素抗體(peanut agglutinin antibody，PNA，B-1075)購自美國Vector 公司，驢抗小鼠IgG(H+L)二抗Alexa Fluor 488(A21202)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，羅丹明標(biāo)記鏈霉親和素(123126)購自美國Jackson Immunology 公司，羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(CA1610)和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液(C0060)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 Cyp4v3-/-小鼠模型構(gòu)建

利用clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9技術(shù)，針對Cyp4v3基因第一外顯子設(shè)計(jì)sgRNA序列，選定其靶位點(diǎn)為CGCAGCGAGCGCGGTCTCCC(圖1)，構(gòu)建Cas9/sgRNA質(zhì)粒并將其顯微注射入C57BL/6J小鼠受精卵內(nèi)，選定F0代Cyp4v3-/-小鼠與WT小鼠交配繁殖并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

WT,wild type.圖1 Cyp4v3-/-小鼠基因組DNA缺失11 bp c.278_288delCGCGGTCTCCCFigure 1 Genomic DNA of Cyp4v3-/-mouse deleting 11 bp c.278_288delCGCGGTCTCCC

1.4 小鼠基因型鑒定

1.4.1小鼠DNA提取 取0.5 cm長度小鼠尾巴，按照血液基因組 DNA 抽提試劑盒相應(yīng)步驟提取小鼠基因組DNA。取2 μL DNA提取物于ND2000超微量分光光度計(jì)的檢測小孔中進(jìn)行DNA純度和濃度的檢測。DNA提取物可用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃保存。

1.4.2PCR 擴(kuò)增相應(yīng)片段 在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因庫中找到小鼠Cyp4v3基因的基因組DNA序列(NC_000074.6)，按照相應(yīng)的引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)上下游引物，并交由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。上游引物序列為5′-TGGTGCAGACG-CTACAGATT-3′,下游引物序列為5′-AGGTGT-CTCTGACTGACGAGG-3′，產(chǎn)物長度為494 bp。PCR反應(yīng)采用25 μL體系，含有12.5 μL 2×Taq Master Mix，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，DNA模板50 ng，用無RNA酶的水補(bǔ)齊25 μL體系。使用下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃ 3 min預(yù)變性；然后進(jìn)入循環(huán)95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃ 5min徹底延伸。

1.4.3測序分析 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測序，使用Chromas軟件對測序峰圖進(jìn)行分析，確定突變位點(diǎn)。

1.5 小鼠眼底彩照檢查

實(shí)驗(yàn)開始前15 min小鼠用1%阿托品散瞳，后用1.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三溴乙醇麻醉劑腹腔注射，并再一次散瞳。使麻醉后的小鼠平躺于Micro Ⅲ小動(dòng)物視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)，在小鼠眼球上滴加適量2%羥甲基纖維素以改善鏡頭及角膜的接觸效果。升降、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)臺(tái)使小鼠眼球位于合適位置，調(diào)整焦距與光強(qiáng)得到清晰小鼠眼底圖像，用Micro Ⅲ軟件拍攝采集圖像。

1.6 小鼠ERG檢查

將小鼠暗適應(yīng)16 h后準(zhǔn)備用于電生理檢查，所有操作均在暗紅色光下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前15 min，用1%阿托品將小鼠散瞳，后用1.25%三溴乙醇麻醉劑腹腔注射麻醉小鼠并再一次散瞳。將麻醉后的小鼠置于加熱的視覺電生理儀的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，將地電極插入小鼠尾巴根部，參考電極插入小鼠下頜，兩個(gè)金箔電極輕微接觸小鼠左右眼角膜緣處，滴加適量2%羥甲基纖維素，改善電極與角膜接觸效果。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)內(nèi)運(yùn)行程序，分別為暗適應(yīng)閃光強(qiáng)度為0.003、0.01、0.1、1、3、10、100 cd·s/m2(背景光強(qiáng)度為0 cd·s/m2，刺激間隔為15 s，記錄3個(gè)ERG信號(hào)的平均值)；明適應(yīng)閃光強(qiáng)度為3、10、30、100 cd·s/m2(明適應(yīng)時(shí)間為5 min,背景光強(qiáng)度為30 cd·s/m2，刺激間隔為15 s，記錄5個(gè)ERG信號(hào)的平均值)以及明適應(yīng)閃光強(qiáng)度為3、10 cd·s/m2，頻率為10 Hz閃爍ERG。

1.7 小鼠眼球冰凍切片免疫熒光染色

用眼科剪將小鼠眼球小心取下，放入4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛4 ℃固定2 h后在體視顯微鏡下去前節(jié)，繼續(xù)在4%多聚甲醛固定，然后使用30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖溶液脫水。將小鼠眼球放入冷凍包埋劑中，用鑷子將小鼠眼球擺好方向后放入液氮內(nèi)迅速冷凍，后可進(jìn)行冰凍切片。切片厚度7 μm，4 ℃預(yù)冷的丙酮固定10 min后晾干放入-80 ℃保存。切片恢復(fù)室溫用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗3次后，用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))血清室溫封閉1 h，在組織上滴加一抗工作液，4 ℃過夜孵育。取出玻片恢復(fù)室溫后，PBS清洗3次，滴加二抗工作液，室溫孵育1 h。PBS清洗3次后，滴加DAPI稀釋液，室溫孵育10 min，PBS清洗3次后滴加防熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片后采集圖像。

1.8 小鼠RPE鋪片鬼筆環(huán)肽染色

用眼科剪將小鼠眼球取下，浸入預(yù)冷的PBS中15 min，將小鼠眼球轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定1 h，在體視顯微鏡下去前節(jié)，將神經(jīng)視網(wǎng)膜與RPE層分離，并將RPE層均勻剪成4瓣。將RPE鋪片用預(yù)冷的PBS清洗3次后放入0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Triton中通透20 min，后用PBS清洗3次。將RPE鋪片放入96孔板的一個(gè)孔內(nèi)，加入鬼筆環(huán)肽工作液，室溫孵育1 h，PBS清洗3次后將RPE鋪片置于載玻片上展平，滴加少量封片劑用蓋玻片封片后采圖。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同月齡Cyp4v3-/-小鼠和WT小鼠組間ERG各波幅差異比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

小鼠DNA提取物的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，得到三種基因型小鼠，分別為c.285del1bp、c.285_286del2bp、c.278_288del11bp，選擇Cyp4v3基因第一外顯子c.278_288del11bp(CGCGGTCTCCC,圖1)小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。上述變異導(dǎo)致CYP4V3蛋白讀碼框發(fā)生移碼，形成提前出現(xiàn)的終止密碼子，所轉(zhuǎn)錄的mRNA將發(fā)生NMD途徑降解，導(dǎo)致該模型小鼠體內(nèi)CYP4V3蛋白缺失，進(jìn)而影響其功能。

2.2 不同月齡小鼠眼底彩照檢查

我們分別在Cyp4v3-/-小鼠3、6、12月齡時(shí)進(jìn)行眼底彩照檢查(圖2)。與WT小鼠相比(圖2D)，Cyp4v3-/-小鼠在3月齡時(shí)眼底彩照未出現(xiàn)明顯變化(圖2A)，隨著年齡增長，6月齡時(shí)可以在眼底觀察到散在的、主要分布于后極部視網(wǎng)膜的黃白色結(jié)晶，且伴隨著輕微的色素沉積(圖2B)，到12月齡時(shí)，眼底彩照顯示Cyp4v3-/-小鼠眼底結(jié)晶減少甚至很難發(fā)現(xiàn)，但是色素沉積情況嚴(yán)重，且出現(xiàn)斑塊狀改變，可以觀察到RPE-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮(圖2C)。

A,color fundus photography of WT mouse;B,color fundus photography of Cyp4v3-/-mouse in 3 months;C,color fundus photography of Cyp4v3-/-mouse in 6 months;D,color fundus photography of Cyp4v3-/-mouse in 12 months.WT,wild type.圖2 不同月齡Cyp4v3-/-小鼠與WT小鼠眼底彩照Figure 2 Color fundus photography of different ages of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse

2.3 不同月齡小鼠ERG檢查

我們分別在3、6、12月齡時(shí)取Cyp4v3-/-小鼠和對應(yīng)的WT小鼠同時(shí)進(jìn)行ERG檢查，結(jié)果顯示在3月齡時(shí)，與WT小鼠相比，Cyp4v3-/-小鼠在暗適應(yīng)各刺激強(qiáng)度下的a波和b波振幅沒有明顯降低(圖3A)；在6月齡時(shí)，Cyp4v3-/-小鼠暗適應(yīng)各刺激強(qiáng)度下的a波振幅總體低于WT小鼠，且有4個(gè)刺激強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而暗適應(yīng)所有刺激強(qiáng)度下的b波振幅均低于WT小鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)；在12月齡時(shí)，Cyp4v3-/-小鼠在暗適應(yīng)和明適應(yīng)的所有刺激強(qiáng)度下的a波和b波的振幅均明顯低于WT小鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。明適應(yīng)的閃爍光ERG同樣也是Cyp4v3-/-小鼠在兩個(gè)強(qiáng)度刺激下的b波振幅均低于WT小鼠，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)。

A,ERG responses of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse in 3 months(n=6);B,ERG responses of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse in 6 months(n=5);C,ERG responses of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse in 12 months(n=7).*P<0.05,▲P<0.01,WT mouse vs.Cyp4v3-/-mouse.WT,wild type;ERG,electroretinogram.圖3 不同月齡Cyp4v3-/-小鼠與WT小鼠ERGFigure 3 ERG responses of different ages of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse

2.4 不同月齡小鼠與WT小鼠比較神經(jīng)視網(wǎng)膜變化

分別在Cyp4v3-/-小鼠3、6、12月齡時(shí)取材進(jìn)行冰凍切片免疫熒光染色，與相應(yīng)的WT小鼠進(jìn)行比較。分別用1D4抗體結(jié)合的視紫紅質(zhì)標(biāo)記視桿細(xì)胞，PNA抗體標(biāo)記視錐細(xì)胞，觀察Cyp4v3-/-小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜層尤其是感光細(xì)胞變化，結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Cyp4v3-/-小鼠的視桿細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)沒有明顯變化，視錐細(xì)胞數(shù)量和視錐細(xì)胞外節(jié)形態(tài)也未發(fā)現(xiàn)明顯改變(圖4)。

WT,wild type;PNA,peanut agglutinin antibody.圖4 不同月齡Cyp4v3-/-小鼠與WT小鼠1D4和PNA抗體免疫熒光染色(×40)Figure 4 Immunofluorescence staining of different ages of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse in 1D4 and PNA antibody(×40)

2.5 不同月齡小鼠與WT小鼠比較RPE結(jié)構(gòu)變化

取3、6、12月齡Cyp4v3-/-小鼠和對應(yīng)月齡的WT小鼠進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色以觀察其特異標(biāo)記的F-actin蛋白，以此來評(píng)估Cyp4v3-/-小鼠RPE的形態(tài)結(jié)構(gòu)。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，Cyp4v3-/-小鼠隨著年齡增長，RPE細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變。3月齡時(shí)，未見明顯變化；6月齡時(shí)，Cyp4v3-/-小鼠的RPE細(xì)胞六邊形結(jié)構(gòu)稍松散，且變形；到12月齡時(shí)，Cyp4v3-/-小鼠的RPE細(xì)胞六邊形形狀明顯擴(kuò)大且不規(guī)則(圖5A)。我們選取同等大小視野計(jì)數(shù)其中RPE細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示在3和6月齡時(shí)，Cyp4v3-/-小鼠的RPE細(xì)胞數(shù)量均少于WT小鼠，但是差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在12月齡時(shí)Cyp4v3-/-小鼠的RPE細(xì)胞數(shù)量明顯少于WT小鼠，而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。

A,phalloidin staining of 3，6，12 months old Cyp4v3-/-mouse and WT mouse(×40);B,analysis of the RPE cells(n=3).*P<0.05,WT mouse vs.Cyp4v3-/-mouse.WT,wild type;RPE,retinal pigment epithelium.圖5 不同月齡Cyp4v3-/-小鼠與WT小鼠鬼筆環(huán)肽染色及RPE細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果Figure 5 Phalloidin staining of different ages of Cyp4v3-/-mouse and WT mouse and statistics analysis of RPE cells

3 討論

本研究建立了一個(gè)Cyp4v3-/-小鼠模型，隨著年齡增長，該小鼠模型可模擬BCD患者的一些臨床癥狀，包括眼底結(jié)晶樣物質(zhì)沉積、視網(wǎng)膜電生理功能下降、RPE細(xì)胞-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮，為研究BCD發(fā)病機(jī)制和基因治療提供了有效模型。

此前，Lockhart等[25]于2014年創(chuàng)建了部分外顯子1到外顯子11以及全部的外顯子2到外顯子10大片段缺失的Cyp4v3-/-小鼠模型,與該模型相比，(1)本研究所建立的小鼠模型同樣可模擬患者BCD的臨床改變，比如存在眼底黃白色結(jié)晶樣沉積；(2)Lockhart等[25]的研究未對RPE細(xì)胞進(jìn)行鑒定，本研究中我們發(fā)現(xiàn)該小鼠存在RPE細(xì)胞病變，為后續(xù)進(jìn)行BCD機(jī)制研究提供借鑒；(3)與大片段缺失Cyp4v3-/-小鼠模型相比，本研究建立的小鼠模型由于僅缺失11 bp，有利于進(jìn)行基因編輯治療的研究。

根據(jù)Yuzawa等[7]的研究，將BCD分為三個(gè)階段：第一階段，在黃斑區(qū)域觀察到RPE萎縮，并伴有均勻的細(xì)小白色結(jié)晶沉積物；第二階段，RPE萎縮范圍逐漸擴(kuò)大，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管也開始在后極萎縮，病變中的晶體沉積物的形狀和大小各不相同，并且有融合的趨勢；第三階段，在整個(gè)眼底觀察到RPE-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮，但是結(jié)晶樣沉積逐漸減少甚至消失。此時(shí)，疾病晚期的BCD患者眼底改變與嚴(yán)重的視網(wǎng)膜色素變性患者很難區(qū)分。本研究中Cyp4v3-/-小鼠的眼部病理改變均與BCD患者的臨床癥狀變化過程非常相似。

許多研究發(fā)現(xiàn)，BCD患者的癥狀嚴(yán)重程度與RPE萎縮區(qū)域大小以及脈絡(luò)膜厚度相關(guān)[14,26]。Rossi等[10]發(fā)現(xiàn)，在一些具有相同基因型的患者中視網(wǎng)膜內(nèi)結(jié)晶樣沉積的積累程度不同，ERG結(jié)果也各有不同。OCT結(jié)果顯示有3例患者盡管存在神經(jīng)視網(wǎng)膜紊亂和高反射性，但是其中央凹中保留了外界膜，RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管萎縮情況好于其他患者，這3例患者的視力好于其他患者。我們據(jù)此推測，BCD患者的臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度可能與RPE和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的萎縮相關(guān)，因此，本研究用鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記RPE的F-actin蛋白以顯示六邊形邊界，觀察到Cyp4v3-/-小鼠的RPE在疾病后期形狀改變，排列松散，且單位面積內(nèi)數(shù)量減少，這與Xiong等[27]發(fā)現(xiàn)RPE對腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)毒性反應(yīng)的表現(xiàn)相似，而且Xiong等[27]發(fā)現(xiàn)，RPE比感光細(xì)胞對AAV的毒性反應(yīng)更敏感，所受損傷更明顯。

目前已知RPE在眼的正常發(fā)育、視網(wǎng)膜正常結(jié)構(gòu)的維持等方面都起著重要作用[28]。RPE對感光細(xì)胞脫落的外節(jié)碎片的吞噬以及后續(xù)的消化處理對維持感光細(xì)胞乃至整個(gè)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)有重要作用。RPE在視循環(huán)中同樣起重要，其中存在許多參與視循環(huán)的重要的蛋白以及酶[29]。Nakano等[30]發(fā)現(xiàn)在ARPE-19細(xì)胞中，CYP4V2是其表達(dá)的主要細(xì)胞色素P450，并且發(fā)現(xiàn)CYP4V2蛋白存在于視網(wǎng)膜和角膜的上皮細(xì)胞中，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，他們還發(fā)現(xiàn)CYP4V2是一種飽和中鏈脂肪酸的選擇性ω-羥化酶，N-羥基-N′-(4-正丁基-2-甲基苯基甲，HET0016)是該酶的抑制劑。Hata等[31]建立了BCD患者來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)并分化成人的RPE細(xì)胞，且該患者特異性iPSC-RPE細(xì)胞可以出現(xiàn)空化細(xì)胞質(zhì)的類似于BCD患者死后標(biāo)本中出現(xiàn)的變性，在該研究中發(fā)現(xiàn)，BCD患者來源的iPSC-RPE細(xì)胞表現(xiàn)出溶酶體功能障礙和自噬通量受損，隨后細(xì)胞死亡。根據(jù)以上研究我們可以發(fā)現(xiàn)，CYP4V2在人的RPE細(xì)胞中表達(dá)豐富，并在BCD疾病進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。本研究中我們尚未對BCD發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，對BCD中RPE受損機(jī)制也需要進(jìn)一步研究探討。

本研究中，我們進(jìn)一步證明Cyp4v3-/-小鼠同樣以RPE細(xì)胞變性受損為主要特征，感光細(xì)胞變性不明顯。本研究的重要意義是建立了模仿人類BCD疾病的小鼠模型，并將疾病的主要損傷部位定位于RPE細(xì)胞，為后續(xù)BCD的致病機(jī)制及基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。