一株降解纖維素的低溫放線菌Streptomyces azureus及產酶條件優化

李 婷，王 玥，劉中珊，劉 奇，徐赫男，李沖偉

（1黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150080；2黑龍江大學生命科學學院黑龍江省寒地生態修復與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150500；3哈爾濱華美億豐復合材料有限公司，哈爾濱 150500）

0 引言

堆肥發酵作為農業廢棄物規范化、集中化和資源化利用的主要途徑之一，因其具有成本低、有機物降解快、無害化程度高等優勢，在國內外農業廢棄物處理方面得到廣泛應用[1]。在中國北方地區，由于低溫持續時間較長（4～6個月），導致腐熟過程無法快速啟動和有效發酵，降低了堆肥材料的代謝和反應速度，堆肥效果受到抑制[2-3]。有研究表明，堆體溫度低于20℃，大多數微生物的新陳代謝減慢，堆肥周期延長；環境溫度≤15℃，堆肥過程難以自發進行[4]。早在1985年，Strom等[5]發現微生物對堆肥啟動有著重要作用，在堆肥中添加微生物可以使低溫堆肥啟動困難的現象得到緩解。Yousif等[6]在低溫堆肥中接種了低溫纖維素降解真菌，提高了低溫堆肥的啟動溫度，取得了非常好的效果。堆肥過程產生的大部分熱量主要來自微生物對有機物的酶解作用[7]。Xie等[8]研究表明低溫菌株能促進堆肥過程快速通過啟動期，對堆肥過程中溫度的升高、酶活性的提高和有機質的降解均有積極作用。也有研究表明，與接種中溫微生物相比，低溫微生物的添加提高了堆肥的甲烷產量和揮發性固體的去除率[9-10]。目前為止，在堆肥中添加的啟動菌大多數是細菌和真菌，對放線菌的研究較少。放線菌是堆肥過程中重要的一類微生物，雖然它們生長速度較慢，但具有耐溫、對極端環境適應性強、易于基因改造等優點。同時，在堆肥的高溫階段，放線菌可以形成孢子以抵抗惡劣環境[11]。有研究發現，接種放線菌不僅改變了堆肥過程的微生物群落結構，還使得纖維素、木質素和半纖維素的降解效率得到了有效提高，這是由于其提高了纖維素酶、木聚糖酶和漆酶的活性,并能使得木質素過氧化物酶及錳過氧化物酶等關鍵酶活性增強[12-13]。篩選有效的低溫纖維素降解菌株，不僅能加快堆肥腐熟進程，而且能夠將資源利用效率最大化，對環境的可持續發展具有重要意義。

本研究從紅松混交林凋落物層采集土壤，采用稻稈粉培養基富集，通過剛果紅平板染色和3`5-二硝基水楊酸法（DNS法）篩選高效降解纖維素的放線菌，通過生理生化試驗和16S rDNA基因序列對菌株進行鑒定，采用響應面法對菌株的產酶能力進行優化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土壤樣品，采集于哈爾濱東亞之窗公園落葉闊葉紅松混交林，采集時間2019年10月9日，樣品采集后保存在-80℃冰箱中備用。

1.2 培養基及配方

秸稈粉培養基、羧甲基纖維素鈉培養基、LB固體培養基、高氏一號培養基、液體發酵產酶培養基配制參考吳靜、沈大春等[14-15]的方法。

1.3 低溫纖維素降解菌的分離與篩選

稱取8.0 g土樣與3.0 g秸稈粉，加入100 mL蒸餾水，160 r/min振蕩10天。

取培養的富集液1 mL進行稀釋，將10-3，10-4，10-5和10-6稀釋液依次于高氏一號培養基上進行涂布，于15℃培養箱中培養2天，挑取單菌落，純化培養。

將純化后長勢較好的單一菌落挑出，經CMC固體培養基培養時間2～3天后，利用剛果紅染色液(1 mg/mL)進行覆蓋染色15 min，棄上層染色液，并利用NaCl洗脫液(1 mol/L)洗脫15 min，棄掉洗脫液，可得到未被著色的透明圈，分別記錄透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)，每個實驗重復3次。

1.4 纖維素酶活力測定

纖維素酶活力測定采用DNS法，參照國標GB-T 35808—2018。

1.5 生理生化試驗

將高效降解纖維素的放線菌菌株T23-B，經LB培養基振蕩培養72 h，取菌液1 mL梯度稀釋后依次涂布于秸稈粉培養基，37℃恒溫培養72 h得到單菌落，觀察并記錄菌落形狀、透明度、隆起形狀、顏色、邊緣、表面以及革蘭氏染色。

1.6 分子鑒定

菌株T23-B進行純培養，利用CTAB法提取總DNA，PCR擴增并測序。引物為通用引物，正向引物為27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物為 1492R(5’TACGGCTACCTTGTACGACTT-3’)。PCR反應體系（共25 μL）：DNA(70 ng/μL)模板1 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)12.5 μL；27F(20 μmol/L)1 μL；1492R(20 μmol/L)1 μL；補 足 ddH2O 到25 μL[16]。將所得產物經試劑盒純化，送至哈爾濱奧恒生物科技有限公司測序。

1.7 纖維素酶活力單因素實驗

選取溫度15、20、25、30、35、40℃，時間24、48、72、96、120 h，培養液pH 5、6、7、8、9，氮源種類（硫酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鉀、硝酸鈉、酵母膏），碳源種類（蔗糖、纖維素、可溶性淀粉、CMC-Na、甘露醇），氮源濃度2、4、6、8、10 g/L，碳源濃度5、10、15、20、25 g/L單因素，考察不同單因素對纖維素酶活力的影響。

1.8 響應面優化試驗

結合單因素試驗結果，響應值(Y)采用纖維素酶活力，進行Box-Behnken試驗設計。選取pH(A)、氮源濃度(B)、碳源濃度(C)3個變量設計響應面試驗，具體因素與水平設計見表1。

表1 Box-Behnken設計因素水平表

1.9 統計分析

使用Design Experts 8.0軟件繪制響應面圖，使用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選

利用CMC瓊脂平板培養24 h，經染色脫色后菌落周圍形成纖維素-溶劑區的透明圈，通過透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值初步鑒定纖維素酶活。結果如表2所示，從凋落物層土壤中初步篩選出了7株D/d比值大于3的放線菌菌株，其中T23-B的比值最大為5.40，T23-B透明圈的結果如圖1所示。T23-B菌株的纖維素酶活力最高為28.34 U/mL，選擇該菌株進一步鑒定。

表2 透明圈大小和CMC酶的活性

圖1 T23-B菌落透明圈

2.2 T23-B生理生化指標及分子鑒定

菌株T23-B菌落呈圓形，不透明，表面粗糙，具有褶皺，邊沿不平整，淡藍綠色。生理生化鑒定表明，該菌為革蘭氏陽性菌，明膠液化和V-P實驗顯陽性，生理生化具體特征見表3。

表3 T23-B菌株的生理生化特性

T23-B菌株經PCR擴增后DNA片段均為單片段，每單片長度約為1500 bp。PCR產物進行測序，得到全長1407 bp基因序列，與電泳結果一致（圖2）。16S rRNA基因序列與核糖體數據庫比對T23-B菌株與遠青鏈霉菌(Streptomyces azureus)菌的同源性為99%，系統進化樹由MEGA7.0進行聚類并構建，如圖3所示。

圖2 T23-B菌株電泳圖

圖3 T23-B菌株的系統發育樹

2.3 T23-B產酶條件優化

2.3.1 產酶條件單因素優化 選擇最佳溫度、最佳培養時間及最佳pH對菌株T23-B的產酶條件進行單因素優化，結果如圖4(a-c)，溫度低于25℃，酶活力隨著生物量的增長而增大，25℃菌株最大生物量，菌株的生物量及酶活均隨溫度的升高下降，當溫度達到35℃，酶活力升至最高，為28.77 U/mL(P<0.01)，96 h時酶活力趨于平緩為40.3 U/mL(P<0.01)；當pH 5.0時酶活力最高為32.5 U/mL(P<0.01)。

選取7種不同的氮源，探究氮源對纖維素酶活的影響，如圖4d所示，以酵母浸粉為氮源時，最高酶活力可達到81.9 U/mL(P<0.01)，明顯高于其他氮源種類。以酵母浸粉為氮源，進一步考察不同氮源含量對纖維素酶活產量的影響，如圖4e所示，酵母浸粉含量為8 g/L時，酶活力可達到92.7 U/mL，因此選擇8 g/L作為最佳氮源含量。

選取5種不同的碳源，考察不同碳源對纖維素酶活產量的影響，如圖4f所示，甘露醇以為唯一碳源時，酶活力達到75.6 U/mL(P<0.01)，顯著高于其他碳源種類，因此選擇甘露醇作為最適碳源。以甘露醇為唯一碳源，考察不同碳源含量對對纖維素酶活產量的影響，如圖4g所示，甘露醇含量為15 g/L時，菌株T23-B產纖維素酶能力最強，酶活力達到109.7 U/mL，因此15 g/L作為最佳碳源含量。

圖4 T23-B產酶條件的優化

2.3.2 產酶條件響應面優化 為了進一步優化菌株T23-B的產酶條件，以單因素試驗結果為基礎，纖維素酶活力為響應評價指標，選取pH、氮源濃度和碳源濃度作為主要影響因素，進行Box-Behnken實驗，實驗設計與結果如表4所示。回歸模型方差分析P(Pr>F)<0.0001，模型效應極顯著，模型失擬項的顯著性水平P=0.8840＞0.05，表明模型失擬不顯著。回歸方程的相關系數R2=0.9922，R2Adj=0.9821，變異系數為1.72%表明該模型與實際試驗擬合程度較好，實驗誤差較小方程擬合良好，變異幾率低。二次回歸擬合方程(1)。

表4 Box-Behnken試驗結果

式中y為預測值，A、B和C分別為pH、氮源濃度和碳源濃度。

以各因素對試驗結果的影響程度為：B（氮源濃度）＞C（碳源濃度）＞A(pH)，利用響應面擬合方程得到3個關鍵因素的擬合值分別為：pH 5.2，氮源濃度為7.8 g/L，碳源濃度為15.6 g/L。該擬合值條件下模型的預測酶活力最大，為120.5 U/mL。在該擬合值條件下進行培養，測定纖維素酶活為123.43 U/mL，與響應面的預測酶活一致。

3 討論

森林凋落物層土壤中的多種纖維素分解菌，是非常寶貴的微生物資源。本研究從落葉闊葉紅松混交林凋落物層土壤中分離出1株產纖維素酶活力較強的低溫放線菌菌株，命名為T23-B，通過生理生化和分子生

物學鑒定結果可知，T23-B菌株為遠青鏈霉菌(Streptomyces azureus)，其同源性為100%。1959年，Kelly等[17]首次發現并命名了遠青鏈霉菌(Streptomyces azureus)，并另有學者發現該菌株可產硫化氫，蛋白水解作用強，淀粉水解實驗呈陽性，與本實驗結果一致[18]。有研究指出該菌株屬于Streptomyces cyaneus集群，能夠生產硫鏈絲菌素，具有一定抗菌活性，尤其能夠抗多種條件致病菌，是一種較好的硫肽類抗生素[19-21]。有研究表明，當外界條件變得惡劣時，放線菌能夠以孢子的形式存在，相較于其他細菌和真菌，對溫度和pH的耐受性較高，并且接種鏈霉菌可以使堆肥的溫度顯著提升，加快整個堆肥發酵周期[22-23]。鏈霉菌屬能夠高效分泌大量穩定性高和底物特異性強的纖維素酶，可被用來生產酶制劑和抗生素等，或用于造紙污水處理等行業，鏈霉菌屬微生物分泌的纖維素酶耐受溫度在40～50℃，耐受pH 5～12，其穩定性在放線菌

中最好[24]。在自然堆肥過程中，鏈霉菌屬為堆肥中后期的優勢菌屬，使堆體微生物的代謝活性得以提高，增強堆肥中蛋白酶、蔗糖酶的活性，同時，鏈霉菌屬的抗菌活性成為堆肥無害處理的重要因素[25]。以往研究對低溫降解纖維素菌株較少，本次研究結合寒地堆肥條件，篩選對低溫耐受性較強的可降解纖維素的放線菌菌株，獲得T23-B菌株，其可承受0～40℃及pH 4.5～7.0環境條件，并在此條件內能保持代謝和酶活性[26-27]，因此，T23-B菌株屬于耐冷微生物。

圖5 兩因素交互影響纖維素酶活力響應面圖

該菌株最適氮源為8 g/L酵母浸粉，最適碳源為15 g/L甘露醇。酵母浸粉能提供微生物生長必需的優質氮源，并且有機氮源相較于無機氮源具有更為充足的維生素、氨基酸和一些生長因子，因此，酵母浸粉可促進纖維素降解菌產生纖維素酶，這與前人的報道一致[28-30]。該菌株屬好氣性鏈霉菌屬，最適轉速為160r/min，是由于轉速的提高有益于培養基的氧氣含量的增加，從而促進好氧微生物的生長，但轉速過大時產生的剪切力會對菌體造成損傷。隨著培養時間的增加，菌體生物量逐漸增加，96 h生物量趨于平緩，而酶活力在前24 h迅速升高，隨后酶活力上升變慢，96 h趨于平緩，與生物量變化趨勢一致。pH 6時生物量達到最大，而酶活在pH 5時達到最大，這可能是由于酶活受pH影響顯著，或者是pH影響菌株產纖維素酶的能力。pH 5～9的生物量可達最適pH生長量的80%以上，說明T23-B菌株生長對pH不敏感。菌株T23-B可在15℃下生長，在30℃生長效果最好，當溫度達40℃時，酶活力急劇下降，可能是溫度超出了該菌株的生長溫度。菌株纖維素酶產量受溫度影響較大，溫度會影響菌體生長速度及營養消耗，影響膜內外物質，如水分、有機物、各種離子等的交換和吸收[31]。低溫菌會采取適應策略，在較低溫度范圍內保持活性[32]。本研究證明T23-B在15～40℃均有產纖維素酶能力，在15℃時可保持44.9%的最高酶活力，由于鏈霉菌屬是堆肥中后期的優勢菌種，且對環境適應能力強，能夠滿足低溫堆肥條件，可見，該菌株在低溫堆肥將具有非常好的應用前景。

本研究僅對該菌株的纖維素酶活力進行測定及優化，未實際作用于秸稈以及未對秸稈的纖維素結構進行觀察和進一步分析。由于堆肥過程相對復雜，微生物相互作用受外界條件影響較大，該菌株是否對堆肥過程中的有益微生物產生抑制作用，在堆肥實際應用的作用效果有待進一步探索。應進行大田試驗，測定該菌株制備的有機肥施用后是否對土壤中全氮、有效磷、速效鉀等土壤肥力指標及土壤微生物群落產生影響。

4 結論

從紅松混交林凋落物層篩選到1株低溫纖維素降解菌——遠青鏈霉菌(Streptomyces azureus)。單因素試驗表明，T23-B最適培養時間為96 h，最適pH 6.0，最適溫度在30℃，最適轉速160 r/min。響應面分析表明，T23-B最適產酶條件為pH 5.2、96 h、35℃、甘露糖15.6 g/L，酵母浸粉7.8 g/L，在最適產酶條件下纖維素酶活力為123.43 U/mL，較優化前提高了4.4倍。Streptomyces azureus是一株低溫產纖維素酶的放線菌，在北方冬季低溫堆肥發酵中將具有非常好的應用價值，對提高農業廢棄物資源利用和保護寒地生態環境具有重要意義。