2種生物誘抗劑對葡萄霜霉病的誘導抗病作用

王曉琳，吳琴燕，彭燕瓊，鄔 劼，黃潔雪，毛妮妮，吉沐祥

（1江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212400；2江蘇農林職業技術學院，江蘇句容 212499）

0 引言

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉[Plasmopara viticola(Berk.et Curtis)Berl.et de Toni]引起的一種世界性病害，也是中國葡萄產區主要病害之一[1-2]。葡萄霜霉病通常發生在溫和潮濕的葡萄種植區域，是氣候主導的流行性病害，一般危害時造成葡萄損失達20%～30%，嚴重時可達70%～80%，甚至導致葡萄園顆粒無收，造成毀滅性的損失[3]。目前生產上防治葡萄霜霉病還是以化學防治為主，如今的大多數化學殺菌劑都是單一作用位點，以一種方式作用于植物病原體，重復利用這些農藥勢必會帶來抗性。在中國農藥信息網上登記防治葡萄霜霉病的化學農藥主要有：吡唑醚菌酯、烯酰嗎啉、波爾多液、百菌清、克菌丹、啶氧菌酯、代森聯、氰霜唑、雙炔酰菌胺和嘧菌酯等，而登記的生物農藥只有植物源殺菌劑丁子香酚和苦參堿，微生物農藥哈茨木霉菌。寡糖又被稱為低聚糖，通常是由3～10個單糖單元通過糖苷鍵連接構成的。按照構成寡糖的單糖種類劃分，寡糖可分為葡萄糖寡糖、木糖寡糖、果糖寡糖、半乳糖寡糖等。按照功能性劃分，寡糖可分為普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖容易被腸道消化吸收，一般作為甜味劑應用，如蔗糖和乳糖。功能性寡糖通常不容易被機體消化和吸收，但是具有一定的活性[4]。

目前發現殼寡糖、β-葡寡糖和褐藻膠寡糖等能誘導植物產生免疫反應[5-7]。β-1,3-葡寡糖可以作為一種激發子，誘導植物自身免疫系統分泌抗生素，對致病菌產生抗性，從而抵抗病原體的侵入，β-1,3-葡寡糖能夠抑制多種病原性真菌的生長，如煙草軟腐病[8]。氨基寡糖素能誘導植物產生抗性，寡糖植物免疫誘抗劑作用對象廣譜，目前在西瓜[9]、蘋果[10]、馬鈴薯[11]和番茄[12]等植物中均有報道。史茹研究發現5%氨基寡糖素AS用量1500 g/hm2時，對西瓜枯萎病防效為88.2%[9]。0.5%氨基寡糖素AS對蘋果離體枝條有較強的保護作用，對腐爛病的防治效果為89.0%[10]。50倍3%氨基寡糖素噴種+500倍3%香菇多糖噴施葉片可誘導馬鈴薯對瘡痂病產生抗性，防治效果為68.9%[11]。張胡煥[12]發現5%氨基寡糖素AS對番茄葉霉病有一定的防效，與48%苯甲·嘧菌酯SC混用能抗病增效，減少殺菌劑的使用量。氨基寡糖素除具有公認的誘導抗病能力外，還可以增強植物的抗逆能力，如提高植物抗寒性[13]、抗旱性[14]和抗澇性[15]。陸紅霞等[13]研究發現100 ppm氨基寡糖素浸種番茄種子可提高番茄苗的抗寒性。此外，氨基寡糖素還具有促進植物生長、改善作物品質和提高次生代謝物產量等功能[16]。本試驗選用2種誘抗劑β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素對葡萄進行霜霉病試驗，明確2種誘抗劑對葡萄霜霉病抗性生理指標的影響及對霜霉病的防效，旨在為葡萄霜霉病的防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

葡萄：‘夏黑’，樹齡6年。

供試藥劑：β-1,3-葡寡糖由南京理工大學提供；2%氨基寡糖素AS由山東國潤生物農藥有限責任公司生產；50%氟醚菌酰胺WDG由山東省聯合農藥工業有限公司生產。

儀器：Multiskan FC型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；Haier醫用低溫保存箱DW-86L626：青島海爾特種電器有限公司；高通量組織研磨儀TL-48P：上海萬柏生物科技有限公司；移液槍：德國Eppendorf公司。

1.2 試驗時間、地點和試驗設計

本試驗于2017年在句容市華陽街道弘景路1號鎮江市農業科學院葡萄園完成。

試驗設計5個處理。處理1為β-1,3-葡寡糖10倍；處理2為β-1,3-葡寡糖100倍；處理3為2%氨基寡糖素AS 750倍；處理4為50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍；處理5為清水。各處理于6月17日開始第一次噴霧，噴藥采用霧星3JWB-16A背負式電動靜電噴霧器（工作壓力為0.15～0.4 MPa；流量12 L/h；霧滴中徑≤120 μm）噴霧，對照區噴施清水。7天一次，共3次，3次藥后7天調查新梢葉片數和發病葉片數，并按分級標準進行調查，統計分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 葡萄葉片幾丁質酶(CHI)活性測定 使用幾丁質ELISA試劑盒（購自上海羽朵生物科技有限公司）對CHI的活性進行測定，試驗具體操作如下：3次藥后3天和7天分別取新梢發生的完全展開新葉，每處理10片，取保鮮葉片1 g，加入0.5g pvpp和7 mL pH 6.0的磷酸緩沖溶液，碾磨后，靜置提取30 min，離心取上清液，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中CHI活性濃度。CHI活定義為在37℃下，1 mL酶液1 min生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖時所需酶量為1 U。

1.3.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定 應用ELISA試劑盒雙抗體夾心法測定各處理葡萄葉片PAL水平。PAL酶液的制備：分別取各處理材料按照質量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的硼酸緩沖液（pH 8.8，含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA），研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液待測。用酶標儀在450 nm波長下測定光密度(OD450nm)，通過標準曲線計算樣品中PAL活性。以每分鐘光密度變化0.01所需酶量為1 U。

1.3.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 SOD酶液的制備：分別取各處理材料按照質量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.0)，研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液即為待測酶液。SOD以25℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需的SOD量為1 U。

1.3.4 過氧化物酶(POD)活性測定 POD酶液的制備：分別取各處理材料按照質量體積比(g/mL)1:9的比例加入5.4 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)(pH 7.0)，研磨，4℃條件下8000 r/min離心20 min，取上清液即為待測酶液。POD酶活定義為每分鐘內A470變化0.01為1 U。

2 結果與分析

2.1 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片PAL活性的影響

由圖1可知：3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高PAL的活性；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高PAL的活性，β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過低使得它在處理7天后未能顯著提高PAL的活性。

圖1 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片PAL活性的影響

2.2 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片CHI活性的影響

由圖2可知：3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高CHI的活性，其中β-1,3-葡寡糖10倍對CHI活性的提高程度高于2%氨基寡糖素AS 750倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過低使得它在處理后未能顯著提高CHI的活性。

圖2 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片CHI活性的影響

2.3 生物誘抗劑對葡萄葉片POD活性的影響

由圖3可知：3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對POD活性的提高程度高于β-1,3-葡寡糖10倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過低使得它在處理后未能顯著提高POD的活性。

圖3 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片POD活性的影響

2.4 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片SOD活性的影響

由圖4可知，3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖10倍、β-1,3-葡寡糖100倍和2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對照差異不顯著；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和β-1,3-葡寡糖100倍相比對照能顯著提高葡萄葉片SOD的活性，2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對照差異不顯著。

圖4 噴施生物誘抗劑對葡萄葉片SOD活性的影響

2.5 2種生物誘抗產品對葡萄霜霉病的抗病試驗

田間試驗表明，β-1,3-葡寡糖10倍，抗病效果最高，病葉防效為62.59%，病指防效為65.44%，與化學藥劑50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍病葉防效(45.54%)和病指防效(64.11%)無顯著差異。2%氨基寡糖素AS 750倍也有一定的抗病效果，病葉防效為25.83%，病指防效為46.41%，但明顯低于β-1,3-葡寡糖10倍和化學藥劑50%氟醚菌酰胺WDG 3750倍的抗病作用。而β-1,3-葡寡糖100倍，與清水對照無顯著差異（表1）。

表1 β-1,3-葡寡糖等對葡萄霜霉病抗病效果

3 結論與討論

有研究結果表明，植物誘導抗性的產生常常是通過酶催化調節而實現的。植物受到病原菌侵染或被誘導處理后，與抗病反應密切相關的防御酶活性升高是誘導抗性產生的重要機制之一[17]。本研究以β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素為誘導劑，研究其對葡萄霜霉病的誘導抗性，并通過測定β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素誘導后，葡萄葉片防御酶系活性的變化，揭示β-1,3-葡寡糖和氨基寡糖素誘導葡萄產生系統誘導抗病性的可能機制。研究結果表明，3次藥后3天，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高PAL的活性；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高PAL的活性。商文靜[17]研究結果表明，殼寡糖誘導后煙葉體內和抗病性相關的各種防御酶活性均有不同程度的變化，PAL活性在接種后有大幅度升高，這與本研究結果類似。PAL通過催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸這一不可逆過程，從而進入苯丙烷代謝途徑，進一步介導類黃酮、木質素、花青素、植物抗毒素和植物激素等的生物合成，進而合成多種具有抗菌作用的產物，是植物次生代謝的關鍵酶和限速酶，酶活性的高低與植物的抗病性密切相關。噴施生物誘抗劑后，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對POD活性的提高程度高于β-1,3-葡寡糖10倍。POD參與木質素、木栓質和醌類物質的合成，促進侵染點愈合并抑制病原菌果膠分解酶、纖維素分解酶等酶的活性，提高植物抗性。噴施生物誘抗劑后，3次藥后3天和7天，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高CHI的活性，植物的CHI是一種病程相關蛋白，直接催化真菌細胞壁的主要成分β-1,4-聯結的N-乙酰-D-葡萄胺水解，具有直接殺傷或抵抗病原的活性與作用，而且受到水楊酸等其他抗病相關分子的調控，在植物防御過程中發揮著重要作用。噴施生物誘抗劑后，β-1,3-葡寡糖100倍、β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對照差異不顯著；3次藥后7天，β-1,3-葡寡糖10倍和β-1,3-葡寡糖100倍相比對照能顯著提高葡萄葉片SOD的活性，2%氨基寡糖素AS 750倍SOD的活性相比對照差異不顯著。SOD是活性氧清除反應過程中第一個發揮作用的抗氧化酶，能將O2-快速歧化為H2O2和分子氧，是抗逆性相關的酶。

檀志全等[18]研究發現5%氨基寡糖素AS對葡萄霜霉病的預防效果為78.29%，對葡萄炭疽病的預防效果為60.00%。李育林[19]試驗發現3次噴施3%氨基寡糖素AS 250倍液對葡萄霜霉病的防效達74.73%，與化學藥劑40%烯酰嗎啉2000倍液無顯著性差異。本研究結果發現2%氨基寡糖素AS 750倍對葡萄霜霉病的病指防效為46.41%。孫輝[20]研究發現寡聚糖具有體外抑菌活性，能誘導植物的抗病性，表現為降低發病程度，組織病理學及超微結構特征明顯變化，但抗病性誘導需要較高的濃度。本試驗結果發現β-1,3-葡寡糖10倍對葡萄霜霉病的病指防效達60%以上，β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍相比對照能顯著提高CHI，PAL和POD的活性，其中2%氨基寡糖素AS 750倍對PAL活性的提高程度顯著高于β-1,3-葡寡糖10倍。β-1,3-葡寡糖100倍可能是由于濃度過低使得它僅在處理3天后能顯著提高PAL的活性，其他時間這3種酶活均與對照無顯著差異，且田間防效也極差。β-1,3-葡寡糖處理7天后能顯著提高SOD酶活，提高程度與濃度正相關，能夠顯著提高葡萄霜霉病抗性的β-1,3-葡寡糖10倍和2%氨基寡糖素AS 750倍處理均能顯著提高葡萄CHI、PAL和POD酶活，表明足夠濃度的誘抗劑能夠通過誘導植物體內防御酶和抗病相關蛋白活性升高提高植物抗病性。本研究中，防御酶和抗病相關蛋白活性變化是β-1,3-葡寡糖誘導葡萄抗葡萄霜霉病侵染的原因之一。