互花米草根際耐鹽促生菌的篩選及功能研究

冀小草，錢蘭華，張羽，沈雪林，許亞男，吳天惠，熊吟荷，黃彥才，王桃云*

(1.蘇州科技大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；3.蘇州市種子管理站，江蘇 蘇州 215011)

土壤鹽漬化已成為一個(gè)嚴(yán)重的世界性環(huán)境問(wèn)題，在干旱和半干旱地區(qū)尤為嚴(yán)重[1]。自然條件下造成土壤緩慢鹽漬化的原因主要有2個(gè)：一是風(fēng)化過(guò)程巖石的破壞導(dǎo)致各種可溶性鹽類的釋放；二是海洋季風(fēng)與降雨中的鹽分沉積。同時(shí)，人類的一些不合理的生產(chǎn)活動(dòng)也加劇了土壤的鹽漬化，如不合理的開(kāi)荒、以一年生的作物代替多年生的植被及使用鹽水進(jìn)行灌概或排水不及時(shí)等[2]。目前全球鹽堿地面積已達(dá)10.0億hm2，我國(guó)鹽堿地面積約1.0億hm2，而且鹽堿地面積正逐年增加[3]。土壤鹽漬化會(huì)降低農(nóng)作物產(chǎn)量、牧草品質(zhì)與林木成活率，從而危及農(nóng)業(yè)、牧業(yè)和林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，破壞生態(tài)系統(tǒng)自我調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而導(dǎo)致社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展失衡[4-5]。在人口逐年增加、耕地逐年減少的情況下，鹽堿地問(wèn)題已經(jīng)成為制約我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素，開(kāi)發(fā)利用鹽堿地具有重大戰(zhàn)略意義[6]。

目前，對(duì)鹽堿地改良及修復(fù)的方法主要有以下3種[7]：轉(zhuǎn)基因植物及遺傳選育的開(kāi)發(fā)利用；水土工程措施；利用微生物改良鹽堿地減輕鹽脅迫對(duì)作物的危害。轉(zhuǎn)基因植物及遺傳選育的方法操作要求高、耗時(shí)長(zhǎng)，并受到道德和環(huán)境等因素約束，難以推廣；水土保持工程的方法雖然有一定效果，但也存在耗資巨大、難以大面積推廣的問(wèn)題；利用土壤微生物進(jìn)行鹽堿地改良，具有成本低、無(wú)污染、能大范圍推廣的優(yōu)勢(shì)，而且土壤微生物對(duì)鹽堿地作物具有促生活性、增強(qiáng)鹽堿地作物耐鹽生長(zhǎng)能力的作用。因此，有關(guān)根際微生物耐鹽促生的功能活性研究受到廣泛關(guān)注。

互花米草(SpartinaalternifloraL.)是為了保灘護(hù)岸、促淤消浪而從國(guó)外引種的草本植物。它對(duì)氣候、環(huán)境的適應(yīng)性和耐受能力很強(qiáng)，是一種典型的鹽生植物[8-9]。

本研究從互花米草根際土壤篩選具有耐鹽促生作用的植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，并對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)耐鹽菌株的耐鹽促生性能及其對(duì)黃瓜的耐鹽促生作用進(jìn)行研究。以期為改良和修復(fù)鹽堿土、促進(jìn)鹽堿土作物生長(zhǎng)提供新策略，并初步探討互花米草適應(yīng)海灘高鹽環(huán)境的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

土樣采自江蘇省南通市啟東呂四鎮(zhèn)的海邊灘涂互花米草根際，土壤采樣深度為20 cm，采得的根際土壤經(jīng)風(fēng)干、粉碎后過(guò)100目篩待用。

1.2 主要藥品試劑與培養(yǎng)基

1.2.1 主要藥品

瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、鉻天青S、氫氧化鉀、氯化鈉、牛肉浸膏、葡萄糖等均購(gòu)自上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。三氯化鉬、溴百里香酚藍(lán)L-色氨酸、D-(+)-Mallc acid(蘋果酸)、抗壞血酸、3-吲哚乙酸(IAA)、VH等均購(gòu)自阿拉丁(上海)生化科技有限公司。

1.2.2 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NFb培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基(NPA)、有機(jī)磷培養(yǎng)基(OPA)、NFM培養(yǎng)基、胰蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、SIM培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基等。

1.3 耐鹽菌株的分離篩選

土壤菌株分離純化。取處理好的土樣，按錢蘭華等[10]方法進(jìn)行菌株分離純化，然后接種于LB斜面培養(yǎng)基并在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株耐鹽能力測(cè)定。參照Patel等[11]的方法，對(duì)菌株耐鹽能力進(jìn)行測(cè)試。

耐鹽菌株ACC脫氨酶活力測(cè)定。參照趙龍飛等[12]所述方法測(cè)定菌株粗酶液中α-丁酮酸含量，并進(jìn)一步參照Saleh等[13]的方法測(cè)定菌株ACC脫氨酶比活力，其酶活力單位為U·mg-1·h-1。

1.4 優(yōu)勢(shì)耐鹽菌株Y3的各種促生能力測(cè)定

Y3菌株產(chǎn)IAA能力測(cè)定。參照Wichner[14]和吳翔[15]的方法，通過(guò)受試菌株能否使反應(yīng)液變紅來(lái)判斷菌株是否具有產(chǎn)IAA能力。

Y3菌株固氮能力的測(cè)定。依據(jù)楊敬輝等[16]的方法測(cè)定Y3的固氮能力，通過(guò)受試菌株能否使培養(yǎng)基變藍(lán)來(lái)判斷其是否具有固氮能力。

Y3菌株解磷能力測(cè)定。參照Ribeiro[17]和Piromyou[18]所述方法，測(cè)定Y3菌株的解磷能力，根據(jù)受試菌株能否在NPA、OPA平板上形成透明圈判斷其是否具有解磷能力。

Y3菌株產(chǎn)嗜鐵素活性的檢測(cè)。參照Machuca等[19]所述方法，通過(guò)檢測(cè)受試菌株能否在CAS平板上形成橘黃色暈圈來(lái)判斷菌株是否具有產(chǎn)嗜鐵素活性。

Y3菌株產(chǎn)NH3能力測(cè)定。參照康貽軍等[20]的方法，根據(jù)受試菌能否將反應(yīng)液由褐色轉(zhuǎn)為黃色來(lái)判斷其是否具有產(chǎn)NH3能力。

菌株賦值評(píng)估。根據(jù)以上促生能力測(cè)試結(jié)果，參照楊敬輝等[16]的方法對(duì)耐鹽優(yōu)勢(shì)菌Y3的促生潛力進(jìn)行賦值評(píng)估，判定Y3菌株的促生潛能。

1.5 Y3菌株適宜生長(zhǎng)條件確定

利用比濁法在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)試鹽濃度、溫度、pH、光照以及培養(yǎng)方式對(duì)Y3菌株的影響，得到Y(jié)3菌株的適宜生長(zhǎng)條件。

1.6 菌株鑒定

Y3菌株的生理生化特性測(cè)定參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[21]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)[22]。

Y3菌株分子生物學(xué)鑒定參照楊新等[23]所述方法，對(duì)Y3菌株的總DNA進(jìn)行提取，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST與己知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 Y3菌株對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的促生試驗(yàn)

參照錢蘭華等[10]所述方法，測(cè)試Y3菌株對(duì)鹽脅迫下黃瓜種子發(fā)芽的促生作用，測(cè)定黃瓜種子的發(fā)芽率、鮮重和干重，并進(jìn)行比較和分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010作圖，SPASS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽菌株分離篩選

從互花米草根際土壤中共分離篩選出6個(gè)耐鹽菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6。6個(gè)菌株的耐鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，Y3和Y6的耐鹽性能比其余4種菌株要強(qiáng)。同時(shí)，菌株的ACC脫氨酶活性結(jié)果顯示Y3菌株的ACC脫氨酶活性最強(qiáng)，達(dá)到0.61 U·mg-1·h-1(表2)。由各菌株耐鹽實(shí)驗(yàn)和ACC脫氨酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Y3菌株的耐鹽能力和ACC脫氨酶活性都優(yōu)于其余5個(gè)耐鹽菌株，因此，選擇Y3菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

表1 不同培養(yǎng)基平板中菌落數(shù)

表2 不同菌株的ACC脫氨酶比活力

2.2 Y3菌株促生能力

通過(guò)對(duì)Y3菌株的固氮、解磷、產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)IAA、產(chǎn)氨等促生能力進(jìn)行測(cè)試，對(duì)耐鹽優(yōu)勢(shì)菌Y3的促生潛力進(jìn)行賦值評(píng)估，發(fā)現(xiàn)Y3菌株對(duì)于所進(jìn)行的6種促生能力測(cè)試均呈陽(yáng)性(表3)。因此，Y3菌株有這6種相應(yīng)的促生性能，具有很好的促生潛能。

表3 Y3菌株促生潛力

2.3 Y3菌株適宜生長(zhǎng)條件

通過(guò)測(cè)定不同鹽濃度、溫度、pH、光照以及培養(yǎng)方式對(duì)Y3菌株的影響，發(fā)現(xiàn)Y3菌株適宜以振蕩的方式進(jìn)行暗培養(yǎng)，具體適宜生長(zhǎng)條件是鹽濃度6%、溫度30 ℃、pH 4.0(圖1)。

圖1 不同培養(yǎng)條件對(duì)Y3菌株生長(zhǎng)的影響

2.4 Y3菌株的鑒定

2.4.1 生理生化特性

Y3菌株為桿狀，芽孢橢圓；菌落近似圓形，乳白色、不透明、中央隆起有褶皺，邊緣呈鋸齒狀。其生理生化特性鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Y3菌株的生理生化特性

2.4.2 Y3菌株分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)對(duì)Y3菌株的16S rDNA的基因測(cè)序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。菌株Y3的16S rDNA序列與Bacillusmethylotrophicus同源性最高，結(jié)合該菌株的生理生化特性，鑒定菌株為芽孢桿菌屬的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。

2.5 Y3菌株對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的促生作用

Y3對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的促生效果如表5所示。純水+Y3菌液組的黃瓜種子發(fā)芽效果最好，鹽水組即鹽脅迫對(duì)照組的黃瓜種子發(fā)芽效果最差。鹽水+Y3菌液組的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重及總干重比鹽水組均有所增加，其中發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重差異均達(dá)到顯著水平。

表5 Y3菌株對(duì)黃瓜種子發(fā)芽的促生效果

3 小結(jié)與討論

本研究通過(guò)耐鹽及ACC脫氨酶活性測(cè)定，從互花米草根際土壤中分離篩選出6個(gè)耐鹽促生菌株，從中選出Y3菌株進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征以及16S rDNA測(cè)序鑒定出Y3菌株為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。其適宜培養(yǎng)條件為鹽濃度6%、溫度30 ℃、pH 4.0，并以振蕩方式進(jìn)行暗培養(yǎng)。Y3菌株能顯著促進(jìn)鹽脅迫下黃瓜種子的發(fā)芽率及幼苗的生長(zhǎng)，鹽+Y3菌液組的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)、鮮重及總干重比鹽水組均有所增加。Y3菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA、產(chǎn)嗜鐵素、產(chǎn)NH3能力和固氮能力。

研究表明，Y3菌株能在較高鹽濃度環(huán)境中生長(zhǎng)良好，并具有多種促生潛能，因此，Y3菌株在改良鹽堿化土壤、緩解設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤鹽堿化問(wèn)題及高鹽發(fā)酵工業(yè)等方面具有應(yīng)用潛力，在農(nóng)業(yè)中具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)馴化或基因工程手段提高Y3菌株的耐鹽和促生活性及穩(wěn)定性，并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，提高作物耐鹽能力是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

另外，根據(jù)本研究結(jié)果，我們推測(cè)互花米草具有的強(qiáng)耐鹽抗逆能力，或許與其根際土壤中的耐鹽促生菌的耐鹽促生作用有關(guān)聯(lián)，這有待于后續(xù)進(jìn)一步探索研究。