新型冠狀病毒核酸檢測實驗室污染的監測與分析

黃日昇 李軼春 陳文雄 鄧家慶 彭云娟

摘要：目的 通過對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測實驗室的環境SARS-CoV-2核酸監測，發現潛在污染源并采取相應有效措施，消除或避免核酸檢測實驗室污染。方法 在2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫醫院醫學檢驗科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結果突發增多期間，對該實驗室實行去污染源和環境SARS-CoV-2監測。結果 試劑準備區、標本制備處理區環境監測點SARS-CoV-2核酸檢測陰性;擴增及產物分析一區為產物污染，環境監測點均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性，對操作臺面、PA7600熒光定量基因擴增儀擴增倉、分析區空氣進行14天SARS-CoV-2核酸監測，污染物清除期其CT值分別為37.0±1.41，36.8±2.03和37.0±2.16，污染物清除后觀察期CT值分別為45.8±0.38，45.7±0.75和45.8±0.38，差異具有統計學意義（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05）。結論 SARS-CoV-2核酸檢測實驗室制定并落實環境監測制度，行之有效的預防或清除污染措施和應急預案對病原微生物安全防護極其重要。

關鍵詞：新型冠狀病毒核酸檢測;實驗室污染 ;環境監測

【中圖分類號】G644.5?【文獻標識碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）13-02

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）是一種新型β屬冠狀病毒，單鏈 RNA病毒，是引發新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）主要病原微生物，基因組序列約由29kb構成，擁有10個基因，可有效編碼10個蛋白[1]。據國家衛健委公布的《新型冠狀病毒的肺炎診療方案（試行第七版）》[2]，實時熒光RT-PCR是SARS-CoV-2確診病例的診斷標準之一，因其具有高敏感性，特異性好，操作簡單等特點，成為了疫情暴發期間最主要的實驗室檢測手段，廣范應用于各種病原學檢測領域[3-6]，但實驗室也極容易引起污染。依據《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[7]、《實驗室生物安全通用要求》（GB19489）[8]、《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）》[9] 和《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版）》[10] 等要求，SARS-CoV-2核酸檢測必須確保生物安全。本文旨在通過對SARS-CoV-2核酸檢測實驗室的環境SARS-CoV-2核酸監測，發現潛在污染源并采取相應有效措施，消除或避免核酸檢測實驗室污染，為SARS-CoV-2核酸檢測提供建設性意見。

1材料與方法

1.1采樣對象 于2020年5月20日至2020年5月23日北海市中醫醫院醫學檢驗科SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結果突發增多期間，對實驗室試劑準備區、標本制備處理區和擴增及產物分析一區環境監測點進行SARS-CoV-2核酸檢測分析。

1.2儀器與試劑?中山達安DA7600、天隆GENTIER 96熒光定量基因擴增儀、Auto-pure32A型全自動核酸提取儀、鑫貝西生物安全柜、上海康禾H-1微型混合器、LX-300微型離心機;中山達安新型冠狀病毒核酸檢測試劑、廣州賽百純核酸提取試劑、H3-1采樣管、帶過濾芯吸頭。

1.3方法

1.3.1 采樣方法 于SARS-CoV-2核酸檢測假陽性結果突發增多期間，實驗活動與環境消毒前，物表監測點使用病毒采樣拭子蘸取H3-1采樣液，對操作臺面、移液器表面及吸嘴、儲存冰箱、傳遞窗把手、核酸提取儀、熒光定量基因擴增儀擴增倉、生物安全柜內壁反復涂抹，然后采樣拭子回收洗脫至H3-1采樣管;空氣監測則使用空氣沉降法，打開H3-1采樣管蓋子使采樣液暴露于固定監測位置30Min。

1.3.2檢測方法 按照SARS-CoV-2核酸檢測標準程序，對核酸實驗室所有工作區環境監測點進行SARS-CoV-2核酸檢測，結合CT值和熒光曲線判定結果，內源性檢測系統（內標，IC）曲線S型擴增，ORF1ab和N基因同時擴增（CT≤40），結果為SARS-CoV-2核酸陽性;ORF1ab和N基因無擴增（CT≥45），結果為SARS-CoV-2核酸陰性;ORF1ab和N基因無明顯擴增（CT40-45），結果為檢測灰區，需要重測復查;ORF1ab或N基因單通道擴增（CT≤40），重新采集標本復查，復查結果一致時，報告SARS-CoV-2 ORF1ab或N單基因核酸陽性，復查結果為雙基因均陰性時，報告SARS-CoV-2核酸陰性;IC 曲線無S型擴增，需要重測或者重采標本測定[11]。所有該實驗室SARS-CoV-2核酸檢測陽性標本均按要求轉送至北海市疾病預防控制中心核酸實驗室再次復核。

1.3.3污染源清除方法?每天3次，連續7天清洗空調過濾網，對儀器設備（如基因擴增儀擴增倉與外表、生物安全柜內壁、核酸提取儀、移液器等）75%酒精擦拭，500 -1000mg/L的84消毒液擦拭工作臺面、冰箱、傳遞窗把手，拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作臺面等物表，打開實驗室紫外燈照射≥1 h[12-13]，保持開窗通風排氣。

1.3.4污染源清除驗證方法 對實驗室污染區環境監測點連續14天SARS-CoV-2核酸監測，連續7天檢測SARS-CoV-2核酸陰性，判定為污染源清除成功，實驗室可正常使用運行。

1.3.5應急預案的啟動?實驗室生物安全領導小組通過環境監測結果分析污染源并進行生物安全自查，根據污染類型、范圍及危害程度上報醫院生物安全管理委員會，由其決定封閉污染區域，選擇清除污染的方法與清除驗證方法，啟用備用實驗用房和儀器設備，進行生物安全評估等。

1.3.6質量控制?使用中山達安試劑盒配套質控品（批號2020056）、陰性和陽性對照一同與樣本檢測，使用常規質量控制規則，確保可靠的實驗檢測質量。

1.4統計學軟件分析?統計分析采用SPSS 22.0軟件，計數資料以百分比（%）表示，其比較采用卡方檢驗，計量資料以均值±標準差（）表示，其比較采用T檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 實驗區域環境監測點SARS-CoV-2核酸檢測?試劑準備區、標本制備處理區環境監測點SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性，擴增及產物分析一區為產物污染，環境監測點均檢測出SARS-CoV-2核酸陽性，具體見表1至表3。

2.2 污染源清除驗證監測?對擴增及產物分析一區使用污染源清除和驗證方法，啟動SARS-CoV-2核酸檢測實驗室應急預案，連續14天SARS-CoV-2核酸監測，污染物清除后監測期比污染物清除監測期，CT值均值明顯升高，連續7天SARS-CoV-2核酸陰性（CT≥45），差異具有統計學意義（F=5.75，10.28，11.53 均P<0.05），見表4。

3討論

據中新網報道，新冠疫情發生以來，SARS-CoV-2核酸檢測實驗室由原來的2081家增加至4804家，其中1350家為新準入二級醫院實驗室，提高了核酸檢測能力，但同時發現部分臨床基因擴增實驗室設計布局不合理，未能達到相應生物安全防護要求;部分實驗室人員生物安全防護意識嚴重弱化，個人防護用品不足[14];檢測人員資質不符合要求;實驗人員體力及心理負擔過重;生物安全手冊、風險評估程序、標準作業指導書不全或缺失等問題，使SARS-CoV-2核酸檢測實驗室污染風險增加。

目前核酸實驗室污染的主要類型有：①標本污染;②試劑污染;③產物污染。污染處理過程耗時且繁瑣，所以采取有效的預防污染措施極為重要。常見預防實驗室污染措施有：①實驗室布局設置合理。設計有門禁系統并粘貼生物安全警示標識，至少應設置3個獨立工作區域： 試劑儲存區、標本制備區和擴增及產物分析區。各區在空間上相互獨立，實驗用品實行專區專用，處于物理分隔狀態，分別設有緩沖區域。②實驗室人員和物品應按照從一區→二區→三區的單向工作流向制度，不得逆向流動。③嚴格的人員準入進入制度。④核酸檢測實驗室標本制備區設置專用SARS-CoV-2核酸提取間（負壓實驗室，氣壓符合要求）進行病毒核酸提取，避免與其他核酸檢測項目混用，確保生物安全。標本的開蓋、取樣、震蕩等操作必須在生物安全柜內進行，再轉移到全自動核酸提取儀進行核酸提取。該區域操作者需三級生物安全防護，嚴格執行防護用品穿戴程序和互相糾正程序及制度[15-17]。⑤每次實驗結束后執行消毒程序，即使用75%酒精噴灑生物安全柜或其他儀器，然后用一次性紙巾擦拭;實驗室臺面使用1000mg/L有效氯消毒液擦拭，實驗室地面采用500-1000mg/L有效氯消毒液拖地消毒（拖把分區放置，不可以共用），打開生物安全柜及實驗室紫外燈消毒>2h，實驗室所有垃圾均視為有傳染性醫療垃圾，均需高壓滅菌消毒處理。⑥重視實驗室人員的身體和心理健康，適當減少輪流排班次數，注重心理輔導。⑦健全實驗室質量管理體系文件，特別是生物安全管理制度。⑧制定并落實環境監測制度，包括監測頻率（間隔）、取樣方法、取樣主要范圍，任一方法/部位環境監測結果不合格，均應采取相應措施加強實驗室清潔消毒，直至環境監測結果全部合格。

本文通過實驗室環境監測點SARS-CoV-2核酸檢測發現為擴增及產物分析區產物污染，通過實驗跟蹤分析發現，某廠商八聯管加蓋后，在重復高溫變性、低溫退火和延伸三個循環中蓋子變形導致產物片段泄露引起產物污染，采取更換新批次八聯管和使用污染源清除方法后，只用了14天就成功清除了污染源，因此環境SARS-CoV-2核酸監測為污染源的查找分析、污染類型判斷提供了依據，而行之有效的預防或清除污染措施為污染源的清除提供了保障，贏得了時間。

本次SARS-CoV-2核酸檢測實驗室污染處置過程中，實驗室生物安全領導小組迅速自查并把污染類型、范圍及危害程度上報醫院生物安全管理委員會，由其啟用了應急預案，迅速啟用了備用實驗用房和儀器設備（天隆GENTIER 96熒光定量基因擴增儀），為后期SARS-CoV-2污染源清除驗證和臨床標本檢測的正常運行提供了可靠的保障。由此可見在新核酸檢測實驗室規劃時，實驗預備用房尤為重要，我們不單著眼于滿足行業標準的試劑準備區、標本制備處理區和擴增及產物分析區這三個工作區，而應該放眼于未來實驗室發展擴大與應急需求，設計有SARS-CoV-2專用核酸提取間和擴增及產物分析備用區對病原微生物防護十分重要。另外制定應急預案時不單要考慮職業暴露、運輸泄漏、火災、水災、地震等緊急情況，更要考慮實驗室污染、核酸實驗室人員工作突發休克等突發情況的緊急處置能力等。

值得提出的是，COVID-19為當下新發疫情，SARS-CoV-2核酸檢測也是應對疫情新開展項目，本次環境環境監測點采集的樣本數量有限，并不能全部反映整個實驗的污染情況，對于低污染狀態下評價準確性降低，未檢出不代表沒有污染，由此可見制定并落實SARS-CoV-2核酸檢測實驗室預防實驗室污染措施就更顯得重要。

綜上所述！新型冠狀病毒核酸檢測實驗室制定并落實環境監測制度、行之有效的預防或清除污染措施和應急預案對微生物安全防護極其重要。

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作者簡介：黃日昇（1981-），男，本科學士，副主任技師，研究方向：微生物及免疫學，E-mail：HRS_9919@163.com。

通訊作者：李軼春（1974-），男，研究生學歷，副主任技師，E-mail：782383597@qq.com。