卵巢癌細胞中YTHDF2通過miRNA-146a調控EGFR的表達

摘要：N6-腺苷酸甲基化（m6A）修飾是真核細胞中RNA最常見的一種修飾方式，YTHDF2是m6A修飾系統發揮重要作用的基因。文章通過生物信息學和分子生物學實驗結合的方法，驗證了YTHDF2通過miRNA-146a對EGFR基因表達的分子調控機制，該信號通路的闡述有助于從表觀遺傳學角度更好的解釋卵巢癌的發生發展機制，并為卵巢癌的早期診斷和治療提供潛在的有效靶點。

關鍵詞：卵巢癌;m6A;YTHDF2;miRNA-146a;EGFR

Abstract：N6-methyladenosine，namly m6A，acts as the most frequent modification in eucaryotic cells，and YTHDF2 play a significant role in the m6A modification complex. This article demonstratesd that YTHDF2 could modulate the expression of EGFR via miRNA-146a，using the bioinformatics combined with molecular experiments. The establishment of the signal pathway favors the molecular mechanic eluciation of ovarian cancer innitiation and progression，thereby providing a potential candidate for the eraly diagnosis and treatment of ovarian cancer.

Key words： Ovarian cancer;m6A;YTHDF2;miRNA-146a;EGFR

【中圖分類號】R271.1?【文獻標識碼】A?【文章編號】1673-9026（2021）13-02

1 前沿

卵巢癌是常見的女性惡性腫瘤之一，并且是導致女性癌癥死亡的第四大原因，但長期以來，由于對卵巢癌分子發病機制的認識不完全且缺乏早期有臨床意義的篩查標志物，約有50%的卵巢癌在確診時已處于晚期，導致總生存期較差[1]。因此，發掘卵巢癌發生發展相關的分子驅動因子，開發針對早期卵巢癌的篩查方法，對于卵巢癌的早期診斷和治療具有較高臨床應用價值。

到目前為止，在生物體中已經鑒定出超過150種RNA修飾方式，RNA內部修飾主要用于維持mRNA的穩定性，常見的RNA修飾方式有

N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羥基化（m5C）等，但m6A修飾是真核生物RNA中最常見的一種修飾方式[2]。哺乳動物的RNA中大約有0.1–0.4%的腺苷酸存在m6A修飾現象，大約占了所有甲基化核苷酸的50%。與m6A RNA修飾相關的酶系統主要分為三部分：甲基化酶、去甲基化酶、甲基化相互作用蛋白，METTL3，METTL14，WTAP，RBM15/15B，KIAA1429，ZC3H13和METTL16是常見的甲基化酶;ALKBH5、ALKBH3、FTO是常見的去甲基化酶;YTHDF1，YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2是常見的與甲基化相互作用的蛋白[3]。RNA的m6A修飾主要存在于RRm6ACH（[G/A/U][G/A]m6AC[U/A/C]）保守序列，而且主要集中在3′UTR區和長的外顯子內部[3-4]。此外，在mRNA前體（pre-mRNA）和長鏈非編碼RNA中（lncRNA）存在較多的m6A修飾[4]。m6A修飾幾乎可以影響RNA代謝的每一個過程，如：RNA的轉錄、剪接、出核、降解和翻譯等生物學過程，從而調控基因表達[5]。RNA m6A修飾與多種疾病相關，包括腫瘤、神經性疾病和胚胎發育遲緩等。

非編碼RNA是指不編碼蛋白質的RNA，包含rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 和microRNA等，能夠調控腫瘤細胞的增殖、侵襲、細胞凋亡和自噬等多種生理過程[6]。 microRNA是一類重要的非編碼RNA，它能夠影響多種生物學過程，比如免疫反應、炎癥反應和腫瘤形成等[7-8]。

m6A修飾對非編碼RNA的功能、轉運、降解等過程產生調控作用[9-11]：①m6A修飾能夠調控microRNA的加工成熟過程，促進它的降解，進而抑制下游靶基因的表達;②m6A修飾能夠影響多種與細胞增殖和致癌相關的microRNA的轉錄;③miR-106b、miR-18a/b、miR-3607、miR-423、miR-30a和miR-320b/d/e等多種microRNA上存在的m6A修飾能夠影響亞砷酸鹽誘導的腫瘤發生過程。

我們通過m6A在線預測軟件分析發現miR-146a上存在m6A修飾位點，YTHDF2作為m6A修飾系統的重要成員，是否對miR-146a發揮調控作用？此外，通過miRNA靶點預測軟件分析發現EGFR基因是miR-146a下游潛在的作用靶點，那么YTHDF2是否可以通過miR-146a調控EGFR基因的表達轉錄？本研究中我們將分別對以上問題進行探討。

2 材料與方法

（1）細胞培養和RNAi實驗

實驗將采用常用的COV504（漿液性卵巢癌細胞系）和A2780（卵巢子宮內膜樣腺癌細胞系）人卵巢癌細胞系。COV504細胞系培養于添加了10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基 （Life Technologies）。A2780細胞系培養于添加了10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的Eagle培養基（Gibco），所有細胞置于含有5%CO2的37℃濕化培養箱中進行培養。

在RNAi實驗中，使用Lipofectamine 2000進行siRNA轉染，實驗過程需設置陰性對照，siRNA將由RiboBio （廣州，中國）合成。

（2）RNA提取及熒光定量PCR實驗（Quantitative real-time PCR）

使用Trizol（Invitrogen）從組織和細胞中提取RNA，反轉錄實驗使用PrimeScript RT Master Mix（Takara）。SYBR qPCR Mix（Toyobo）用于RT-PCR，采用2-ΔΔCT法評估YTHDF2和EGFR等基因的表達水平，β-actin基因用作內參基因。

（3）miRNA的克隆、表達和檢測

按照pcDNA3.3-TOPO TA克隆試劑盒的操作說明，將192bp的DNA片段（將包含miRNA-146a前體序列）插入哺乳動物表達載體pcDNA3.3-TOPO（Invitrogen），通過測序確認插入片段，將插入片段的新載體命名為pcDNA3.3-miR-146a。按照DOTA脂質體轉染（Roche）試劑盒操作說明，將pcDNA3.3-miR-146a載體轉入COV504和A2780卵巢癌細胞系中。48小時后，使用mirVana miRNA 提取試劑盒（Applied Biosystem）提取miRNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystem）對成熟miR-146a進行定量（2-ΔΔCT）。每個實驗重復三次。

3 結果

3.1卵巢癌細胞中YTHDF2基因在轉錄后水平調控miR-146a的轉錄

我們通過SRAMP（http：//www.cuilab.cn/sramp/）對miR-146a中可能存在的m6A位點進行在線預測，發現miR-146a中存在1個潛在的m6A甲基化位點（圖 1A），且YTHDF2敲除細胞系中miR-146a的轉錄水平存在一定程度的上調（圖 1B），所以我們推測m6A識別蛋白YTHDF2通過識別miR-146a的m6A修飾位點，介導miR-146a的降解，進而在轉錄后水平調控miR-146a的轉錄。

3.2 EGFR是miR-146a的下游靶基因

為了確定miR-146a下游靶基因，我們通過miRmap（http：// mirmap.ezlab.org/），microT（http：//www.microrna.gr/ microT），miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do） 和 PITA（http：//genie.weizmann.ac.il/pubs/ mir07/mir07_data.html）等多種miRNA靶點預測軟件預測miR-146a的下游靶基因，miR-146a能夠靶向結合EGFR基因（圖2A），RT-PCR（圖2B和2C）證明miR-146a的敲除和過表達均能影響EGFR的表達。

3.3 YTHDF2調控EGFR基因的表達

4 討論

文章首次從表觀遺傳學角度揭示了m6A識別蛋白YTHDF2通過miR-146a對EGFR基因的分子調控機制，該信號通路在卵巢癌中的研究在國內外尚屬首次，該通路的建立有助于從表觀遺傳學角度更好的解釋卵巢癌的發病機制，并為卵巢癌早期診斷、臨床分期、分子分型、預后評估、PARP抑制劑耐藥機制等方面的研究提供參考，同時為卵巢癌的靶向/免疫治療提供潛在的、有效的生物標記物。

參考文獻：

[1]Hua W，Zhao Y，Jin X，et al. METTL3 promotes ovarian carcinoma growth and invasion through the regulation of AXL translation and epithelial to mesenchymal transition[J]. Gynecologic Oncology，2018，151（2）： 356-365.

[2]Lan Q，Liu PY，Haase J，et al. The critical role of RNA m6A methylation in cancer[J]. Cancer Research，2019，79（7）： 1285-1292.

[3]Kane SE，Beemon K. Precise localization of m6A in Rous sarcoma virus RNA reveals clustering of methylation sites： implications for RNA processing[J]. Molecular and Cellular Biology，1985，5（9）： 2298-2306.

[4]Lan Q，Liu PY，Haase J，et al. The critical role of RNA m6A methylation in cancer[J]. Cancer Research，2019，79（7）： 1285-1292.

[5]Dai D，Wang H，Zhu L，et al. N6-methyladenosine links RNA metabolism to cancer progression[J]. Cell Death & Disease，2018，9（2）： 1-13.

[6]Fazi F，Fatica A. Interplay between N6-methyladenosine （m6A） and non-coding RNAs in cell development and cancer[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology，2019，7： 116.

[7]Chen Y，Lin Y，Shu Y，et al. Interaction between N 6-methyladenosine （m 6 A） modification and noncoding RNAs in cancer[J]. Molecular Cancer，2020，19： 1-14.

[8]Yi YC，Chen X Y，Zhang J，et al. Novel insights into the interplay between m 6 A modification and noncoding RNAs in cancer[J]. Molecular Cancer，2020，19（1）： 1-10.

[9]Zhang J，Bai R，Li M，et al. Excessive miR-25-3p maturation via N 6-methyladenosine stimulated by cigarette smoke promotes pancreatic cancer progression[J]. Nature Communications，2019，10（1）： 1-15.

[10]Han J，Wang J，Yang X，et al. METTL3 promote tumor proliferation of bladder cancer by accelerating pri-miR221/222 maturation in m6A-dependent manner[J]. Molecular Cancer，2019，18（1）： 1-15.

[11]Gu S，Sun D，Dai H，et al. N6-methyladenosine mediates the cellular proliferation and apoptosis via microRNAs in arsenite-transformed cells[J]. Toxicology Letters，2018，292： 1-11.

作者簡介：第一作者趙強，1986年出生，男，漢族，山東臨沂人，博士，現就職于天津市腫瘤醫院空港醫院，助理研究研員，主要從事腫瘤學研究。

基金項目：天津市衛生健康科技項目（RC20189）