離子對(duì)反相液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定畜禽肉中5種硒形態(tài)含量

魏益華，黃青青，張金艷*，邱素艷, 3，涂田華，袁林峰，戴廷燦，張標(biāo)金，李偉紅，嚴(yán) 寒

1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191 3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(南昌)，江西 南昌 330200

引 言

硒(Se)是人體必需的一種微量元素，為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硒-P蛋白的重要組成部分，在體內(nèi)起著平衡氧化還原氛圍的作用。研究表明，威脅人類健康和生命的40多種疾病，如癌癥、心血管病、肝病、白內(nèi)障、胰臟疾病、糖尿病和生殖系統(tǒng)疾病等都與人體缺硒有關(guān)[1]。然而，硒適量有益身體健康，過(guò)量則有害健康。硒攝入量在缺乏和毒性之間范圍很窄，其推薦攝入量和最高安全攝入量上限分別為成人每天50～200和400 μg[2]。

食物中硒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不僅取決于總含量，更取決于其形態(tài)種類，不同化學(xué)形態(tài)的硒在人體的吸收、生物效應(yīng)、毒性及防癌作用不同[3]。食物中的硒來(lái)源按其存在的形態(tài)，可分為有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒，有機(jī)硒主要形態(tài)有硒代氨基酸、硒代蛋氨酸、硒蛋白和硒多糖等，有機(jī)硒易被人體吸收利用，安全性高； 無(wú)機(jī)硒主要形態(tài)有硒酸鹽和亞硒酸鹽，無(wú)機(jī)硒毒性較大，生物利用率差，故開(kāi)展食品中硒形態(tài)分析具有重要意義。

目前，硒形態(tài)分析方法有： 氣相色譜-質(zhì)譜法[4]，液相色譜-質(zhì)譜法[5]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[7-8]和液相色譜-原子熒光光譜法[9-10]。與其他方法相比，液相色譜-原子熒光光譜法具有儀器購(gòu)置和運(yùn)行成本低，光譜干擾少，線性范圍寬和檢出限較低等諸多優(yōu)點(diǎn)，其元素形態(tài)分析應(yīng)用越來(lái)越多。液相色譜分離硒形態(tài)主要方法為離子交換液相色譜法和離子對(duì)反相液相色譜法，其中己烷磺酸鈉[8]，氫氧化四甲基銨[11]、三氟乙酸[12]、五氟丙酸[13]和七氟丁酸[14]等離子對(duì)試劑用于硒形態(tài)分析研究報(bào)道較多，而四丁基溴化銨用于硒形態(tài)分析研究報(bào)道相對(duì)較少。

食品中硒形態(tài)分析研究對(duì)象主要集中于稻谷[15]，大豆[6]、蔬菜[5]、水果[16]和飼料[17]等植物性樣品。動(dòng)物性樣品硒形態(tài)分析研究極為少見(jiàn)[8, 18]，其測(cè)定方法均為液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，且樣品需冷凍干燥。本研究擬采用液相色譜-原子熒光光譜法對(duì)畜禽鮮肉樣品中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根和硒酸根等5 種硒形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，以期為畜禽肉類樣品中硒形態(tài)分析與研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜(SA 20)-原子熒光光譜儀(AFS 9320，吉天儀器公司)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(CR21N，日立)，pH計(jì)(S2，梅特勒)，微波消解儀(Xpress，CEM)，微控?cái)?shù)顯電熱板(EG 37C，萊伯泰科)，Milli-Q5超純水系統(tǒng)。

硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度均為98%，百靈威公司)； 亞硒酸根(GBW10032)和硒酸根(GBW10033)標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院； 胰蛋白酶(≥2 500 units·mg-1，百靈威)，蛋白酶XIV(≥3.5 units·mg-1，鏈霉蛋白酶，Sigma-Aldrich)； 磷酸氫二銨(ACS)，四丁基溴化銨(離子對(duì)色譜級(jí))，甲醇和甲酸(HPLC)，氫氧化鉀、碘化鉀、鹽酸和硝酸(均為GR)，硼氫化鉀、碘乙酰胺、高氯酸和鐵氰化鉀(均為AR)均購(gòu)置于阿拉丁公司。超濾管(Amicon?Ultra-15，3KDa，密理博公司)。

1.2 樣品硒形態(tài)前處理及液相色譜-原子熒光光譜儀測(cè)試條件

1.2.1 硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的提取與凈化

取一定量的畜禽肉鮮樣充分粉碎混勻。稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL離心管中，加入40 mg胰蛋白酶、40 mg蛋白酶XIV和10 mL 30 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 8.0)，渦旋混勻，于恒溫水浴振蕩器上55 ℃、200 r·min-1條件下震蕩提取 20 h，10 000 r·min-1離心10 min，提取液經(jīng)濾紙過(guò)濾再轉(zhuǎn)移至超濾離心管，于5 000 r·min-1離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，用液相色譜-原子熒光光譜儀測(cè)定樣品溶液中硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量。

1.2.2 硒酸根和亞硒酸根的提取與凈化

取一定量的畜禽肉鮮樣充分粉碎混勻。稱取樣品2.0 g (精確至0.001 g)樣品，置于50 mL離心管中，加入10 mL磷酸氫二銨緩沖液和20 μL 0.5 mol·L-1碘乙酰胺，渦旋混勻，于恒溫水浴鍋上55 ℃、200 r·min-1條件下震蕩提取 20 h，10 000 r·min-1離心10 min，提取液經(jīng)濾紙過(guò)濾再轉(zhuǎn)移至超濾離心管，于5 000 r·min-1離心10 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，用液相色譜-原子熒光光譜儀測(cè)定樣品溶液中硒酸根和亞硒酸根含量。

液相色譜-原子熒光光譜儀條件： (1)液相色譜： 采用C18反相色譜柱(4.6×250 mm，5 μm，Inertsil ODS-3，GL Science)，以30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5%(V/V)甲醇為流動(dòng)相，用20%(V/V)甲酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相溶液pH為 6.0，流動(dòng)相流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為100 μL； (2)在線紫外消解系統(tǒng)： 在線紫外燈消解，還原劑為0.5%(m/v)氫氧化鉀+0.2 %(m/v)碘化鉀； (3)原子熒光光譜： 0.5%(m/v)氫氧化鉀+2.5%(m/v)硼氫化鉀，載流為10%(V/V)鹽酸溶液，硒空心陰極燈主、輔極電流和電壓分別為100 mA，50 mA和310 V，載氣和屏蔽氣流速350和750 mL·min-1。

1.3 樣品總硒前處理及原子熒光光譜儀分析測(cè)試條件

采用《GB 5009.93—2017》中氫化物原子熒光光譜法對(duì)樣品中總硒進(jìn)行測(cè)定[19]。取一定量的雞肉鮮樣充分勻漿，稱取2.0 g(精確至0.001 g)樣品于錐形瓶中，加入9 mL硝酸和1 mL高氯酸，置于電熱板上于160 ℃消解4 h，再升溫至260 ℃趕酸至白煙冒盡，冷卻后加入10 mL(V/V)鹽酸溶液于95 ℃加熱5 min以還原六價(jià)硒成四價(jià)硒，消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加入2.5 mL 10%(m/v)鐵氰化鉀溶液，用水定容至刻度。

原子熒光光譜條件： 還原劑為0.5%(m/v)氫氧化鉀+2.5%(m/v)硼氫化鉀，載流為10%(V/V)HCl，硒空心陰極燈主、輔極電流和電壓分別為100 mA，50 mA和300 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器分析測(cè)試條件的選擇與優(yōu)化

首先，考察了離子對(duì)液相色譜法(IP-RP-HPLC)和陰離子交換液相色譜法(AE-HPLC)對(duì)硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)、硒酸根(Se(Ⅳ))和硒酸根(Se(Ⅵ))的分離度和靈敏度的影響。離子對(duì)液相色譜法采用Inertsil ODS-3 C18反相色譜柱，以30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5% (V/V)甲醇為流動(dòng)相(pH 6.0)，流速為0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，見(jiàn)圖1； 陰離子交換液相色譜法采用Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱，以40 mmol·L-1磷酸氫二銨和5% (V/V)甲醇為流動(dòng)相(pH 6.0)，流動(dòng)相流速為1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃。雖然此兩種方法均能成功分離5種硒形態(tài)，但陰離子交換液相色譜法的硒酸根保留時(shí)間明顯長(zhǎng)于離子對(duì)液相色譜法的硒酸根保留時(shí)間，且其有機(jī)硒(尤其是硒代蛋氨酸靈敏度)較差，故本研究最終采用離子對(duì)液相色譜法分離5種硒形態(tài)。

圖1 IP-RP-HPLC(Inertsil ODS-3色譜柱)硒形態(tài)色譜圖Fig.1 Chromatogram of Se species with IP-RP-HPLC (Inertsil ODS-3)

同時(shí)，考察了不同流動(dòng)相體系對(duì)硒形態(tài)分離的影響，共設(shè)3種流動(dòng)相體系，(1) 磷酸鹽： 30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨和5%(V/V)甲醇(pH 6.0)； (2) 乙酸銨： 25 mmol·L-1乙酸銨、0.1 %(m/v)TFA和5% (V/V)甲醇為流動(dòng)相(pH 6.0)； (3) 檸檬酸： 5 mmol·L-1檸檬酸(pH 4.5)。磷酸鹽和乙酸銨流動(dòng)相體系均可較好的分離5種硒形態(tài)，分離度和靈敏度亦較佳，但乙酸銨流動(dòng)相體系的硒酸根出峰時(shí)間相對(duì)較晚，檸檬酸流動(dòng)相體系的硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸分離較差。

此外，還考察了磷酸鹽流動(dòng)相體系中磷酸氫二銨濃度、四丁基溴化銨濃度、甲醇含量和色譜柱柱溫對(duì)硒形態(tài)保留時(shí)間和靈敏度的影響。實(shí)驗(yàn)表明，磷酸氫二銨濃度、四丁基溴化銨濃度、甲醇含量和pH對(duì)硒酸根保留時(shí)間影響較大，而對(duì)有機(jī)硒保留時(shí)間影響較小。磷酸氫二銨濃度和甲醇含量的增加會(huì)明顯縮短硒酸根保留時(shí)間，而四丁基溴化銨濃度增加會(huì)明顯延長(zhǎng)硒酸根保留時(shí)間。甲醇含量的增加可顯著提高硒形態(tài)靈敏度。色譜柱柱溫對(duì)硒形態(tài)保留時(shí)間和靈敏度幾乎無(wú)影響。

綜上所述，最終流動(dòng)相體系為30 mmol·L-1磷酸氫二銨、0.5 mmol·L-1四丁基溴化銨，5% (V/V)甲醇含量(pH為6.0)，流速0.8 mL·min-1，5種硒形態(tài)Se分離度好，在10 min之內(nèi)可完成5種硒形態(tài)分析測(cè)試工作。

通過(guò)在線紫外燈輻射有機(jī)硒轉(zhuǎn)化成六價(jià)硒，還原劑碘化鉀將六價(jià)硒還原成四價(jià)硒，硼氫化鉀將四價(jià)硒在鹽酸介質(zhì)中還原成硒化氫。值得注意的是，即使在紫外消解系統(tǒng)和碘化鉀還原劑共同的作用下，離子對(duì)反相液相色譜-紫外-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定硒形態(tài)，相同濃度的各種硒形態(tài)峰面積存在明顯差異，其峰面積從大至小一般為： 亞硒酸根>硒酸根>甲基硒代半胱氨酸>硒代胱氨酸>硒代蛋氨酸，其差異原因可能為在線紫外消解系統(tǒng)對(duì)各種硒形態(tài)轉(zhuǎn)化率不同所致。

本研究對(duì)還原劑碘化鉀、硼氫化鉀以及載流(鹽酸)濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到較佳的靈敏度。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)饣洕舛葹?.2%，硼氫化鉀濃度為2.5%，鹽酸濃度為10%時(shí)，硒形態(tài)靈敏度較高。

2.2 樣品處理

2.2.1 蛋白酶種類與用量的選擇

首先，考察了不同蛋白酶對(duì)豬肉樣品中硒形態(tài)提取效果，共設(shè)5個(gè)蛋白酶處理，見(jiàn)圖2。除胃蛋白酶處理提取劑為0.1(V/V)%鹽酸(pH 3.0)，其他處理提取劑均為30 mmol·L-1磷酸氫二銨溶液(pH 8.0)，提取方式為水浴震蕩200 r·min-120 h。樣品提取率等于樣品各種硒形態(tài)含量之和除以樣品總硒含量之和。實(shí)驗(yàn)表明，蛋白酶復(fù)合處理提取效果明顯高于單一蛋白酶處理，胰蛋白酶+蛋白酶XIV提取效果最佳，其次為蛋白酶XIV+脂肪酶，胃蛋白酶提取效果最差。故本實(shí)驗(yàn)最終選擇胰蛋白酶+蛋白酶XIV對(duì)樣品中硒形態(tài)進(jìn)行提取。其次，對(duì)胰蛋白酶+蛋白酶XIV用量進(jìn)行了考察，共設(shè)5個(gè)處理，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)表明，40 mg胰蛋白酶+40 mg蛋白酶XIV、50 mg胰蛋白酶+50 mg蛋白酶XIV對(duì)樣品硒形態(tài)提取率較高，二者提取率無(wú)顯著差異。但由于蛋白酶價(jià)格較高，選取40 mg胰蛋白酶+40 mg蛋白酶XIV用量有利于降低試劑成本。

圖2 不同蛋白酶對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.2 Influences of extraction rates of Se species in samples with different proteases (n=3)

圖3 蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶XIV)不同用量對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響Fig.3 Influences of extraction rates of Se species in samples with different dosage of proteases (trypsin, protease XIV)

2.2.2 樣品提取方式及提取時(shí)間的選擇

首先，考察了水浴震蕩提取、水浴超聲提取和微波提取對(duì)樣品硒形態(tài)提取效果的影響。水浴震蕩提取條件為55 ℃水浴振蕩器上200 r·min-1提取24 h，超聲提取條件為37 ℃超聲30 min×4次(頻率為20 kHz)，微波提取條件為40 ℃微波30 min(微波功率為100 W)。從圖4可知，樣品硒形態(tài)提取率從大至小為： 水浴震蕩提取>水浴超聲提取>微波提取。同時(shí)進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，添加硒形態(tài)種類為硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸以考察提取方式是否會(huì)破壞有機(jī)硒硒形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，水浴提取下有機(jī)硒形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化，超聲提取時(shí)硒代胱氨酸峰附近出現(xiàn)未知物質(zhì)峰，估計(jì)為長(zhǎng)時(shí)間超聲導(dǎo)致硒代胱氨酸形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化所致，微波提取下有機(jī)硒硒形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化，但其提取率較低。故本研究最終選用水浴震蕩提取方式對(duì)樣品中硒形態(tài)進(jìn)行提取。其次，考察了水浴震蕩提取時(shí)間對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響，共設(shè)6個(gè)處理。從圖5可知，當(dāng)水浴震蕩提取時(shí)間≥20 h，樣品硒形態(tài)提取率較好，故最終水浴震蕩提取時(shí)間設(shè)為20 h。

圖4 不同提取方式對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.4 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction means (n=3)

圖5 不同水浴提取時(shí)間對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響(n=3)Fig.5 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction times by water bath (n=3)

2.2.3 樣品提取劑的選擇

由于胰蛋白酶和蛋白酶XIV均為堿性蛋白酶，提取體系中pH值對(duì)酶活力影響較大。三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)和磷酸氫二銨[(NH4)2HPO4]均為常見(jiàn)緩沖液，用作提取劑可起穩(wěn)定pH作用，本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取劑及pH值對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響，共設(shè)5個(gè)處理，(1)水、(2) 30 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)、(3) 30 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、(4) 30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH7.5)和(5) 30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)。從圖6可知，樣品硒形態(tài)提取率從大至小順序?yàn)?0 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)>30 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)>30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 7.5)>30 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)>水，故本方法采用30 mmol·L-1(NH4)2HPO4(pH 8.0)為樣品提取劑。

圖6 不同提取劑對(duì)樣品硒形態(tài)提取率的影響Fig.6 Influences of extraction rates of Se species in samples with different extraction reagents

2.2.4 樣品凈化方式的選擇

樣品經(jīng)蛋白酶水解后，溶液顏色較深，含有較多水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)會(huì)嚴(yán)重縮短色譜柱的使用使命，故本研究考察了不同凈化方式對(duì)樣品溶液顏色的影響以及對(duì)硒形態(tài)添加回收率的影響。共設(shè)4個(gè)處理，樣品提取液未凈化； 樣品提取液經(jīng)超濾管(3KD)離心凈化； C18基質(zhì)固相分散凈化，即提取前往樣品中加入0.2 g C18粉末，其他步驟相同； PSA基質(zhì)固相分散凈化，即提取前往樣品中加入0.2 g PSA粉末，其他步驟相同。實(shí)驗(yàn)表明，樣品凈化后溶液顏色從深至淺依次為： 未凈化>C18>PSA≈超濾，4種凈化方式的有機(jī)硒硒形態(tài)添加回收率無(wú)明顯差異，但PSA會(huì)降低無(wú)機(jī)硒回收率，故本方法最終采用超濾對(duì)樣品溶液進(jìn)行凈化。

2.2.5 碘乙酰胺的作用

在添加回收實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)： 樣品經(jīng)蛋白酶水解，其亞硒酸根回收率非常低，通常為0%～5%，而其他4種硒形態(tài)回收率在80%～110%之間。即使樣品不加蛋白酶水解，只用水或磷酸氫二銨溶液提取，亞硒酸根回收率亦呈同樣結(jié)果，其原因可能為亞硒酸根吸附在樣品顆粒表面，未能解吸到樣品溶液中。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，樣品提取前加入碘乙酰胺溶液，亞硒酸根回收率顯著升至80%以上，其原因可能為碘乙酰胺破壞了蛋白結(jié)構(gòu)或其還原性使亞硒酸根解吸到樣品溶液中。

由于碘乙酰胺是一種氨基酸烷基化試劑，能與硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等有機(jī)硒發(fā)生烷基化反應(yīng)。添加回收實(shí)驗(yàn)亦證明，當(dāng)?shù)庖阴０反嬖跁r(shí)，硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)化，其回收率明顯下降，故同時(shí)測(cè)定畜禽肉中5種硒形態(tài)，樣品提取步驟需要分成兩步，第一步為樣品中有機(jī)硒的提取，其提取需經(jīng)蛋白酶水解； 第二步為樣品中無(wú)機(jī)硒的提取，其提取僅需加入磷酸氫二銨溶液，無(wú)須酶解。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 樣品基體效應(yīng)的考察

通過(guò)往樣品提取液中添加一定量硒形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液以考察樣品基質(zhì)效應(yīng)(ME)。樣品基質(zhì)效應(yīng)=100%×(樣品添加濃度的熒光強(qiáng)度-樣品本底的熒光強(qiáng)度)/標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的熒光強(qiáng)度，假設(shè)80%≤樣品基質(zhì)效應(yīng)≤120%，則認(rèn)為樣品的基質(zhì)效應(yīng)較小，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析測(cè)試即可； 若樣品基質(zhì)效應(yīng)<80%或>120%，則認(rèn)為樣品的基質(zhì)效應(yīng)較大，必須采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。從表1可知，樣品中5種硒形態(tài)基質(zhì)效應(yīng)為83.7%～119%，表明其基體效應(yīng)較小，用普通標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量即可。由于本研究采用的是離子對(duì)液相色譜法，樣品提取劑為30 mmol·L-1磷酸氫二銨(pH 8.0)，故標(biāo)準(zhǔn)溶液亦須用30 mmol·L-1磷酸氫二銨(pH 8.0)進(jìn)行稀釋與定容。

表1 樣品的基質(zhì)效應(yīng)Table 1 Matrix effects of the 5 kinds of Se species in samples

2.3.2 添加回收率和精密度

通過(guò)添加回收率試驗(yàn)以考察方法的添加回收率、批內(nèi)精密度和批間精密度，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。添加回收試驗(yàn)，共設(shè)置低、中、高3個(gè)濃度水平，每平行設(shè)6個(gè)重復(fù)，批內(nèi)精密度為同一批次的測(cè)量結(jié)果，批間精密度為不同批次(3次)的測(cè)量結(jié)果。從表2可知，本方法5種硒形態(tài)添加回收率為76.8%～109%，批內(nèi)精密度和批間精密度分別為2.7%～7.8%和3.5%～12.3%。

表2 豬肉中5種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 2 Standard recovery rates and precisions of 5 kinds of Se species in pork samples (n=6)

2.3.3 方法線性和檢出限

從表3可見(jiàn)，各種硒形態(tài)在5～200 μg·L-1范圍內(nèi)線性良好，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以信噪比S/N=3為檢出限，5種硒形態(tài)檢出限為0.55～0.94 μg·L-1。與其他文獻(xiàn)相比，本方法靈敏度與HPLC-ICP-MS，HPLC-MS/MS靈敏度相近，高于HPLC-TR-HG-AFS靈敏度，且該方法測(cè)定硒形態(tài)種類較多[7, 16, 19]。

表3 5種硒形態(tài)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear range, linear equation, correlation coefficients and detection limits

測(cè)定畜禽肉樣品中總硒含量和硒形態(tài)含量，以觀察本方法對(duì)樣品中硒形態(tài)的提取率。提取率等于樣品各硒形態(tài)含量之和除以樣品總硒含量。從表4可知，本方法樣品硒形態(tài)提取率較高，富硒畜禽肉中主要形態(tài)為硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸，未發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)硒。

表4 樣品硒形態(tài)和總硒含量的測(cè)定(n=3)Table 4 Determination of Se species and total Se contents in samples(n=3)

3 結(jié) 論

建立了一種用離子對(duì)液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒酸根和亞硒酸根5種硒形態(tài)含量的方法。畜禽肉類樣品無(wú)須冷凍干燥處理，鮮樣樣品中有機(jī)硒經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶XIV酶解水浴提取，無(wú)機(jī)硒經(jīng)碘乙酰胺溶液提取，以磷酸鹽體系為流動(dòng)相，四丁基溴化銨為離子對(duì)試劑，經(jīng)C18反相色譜柱分離，10 min內(nèi)可以完全分離5種硒形態(tài)。本方法較為簡(jiǎn)便、靈敏和準(zhǔn)確，為畜禽肉類硒形態(tài)分析與研究提供了切實(shí)可行的分析方法和技術(shù)支撐。