基于拉曼成像技術的面粉中抗壞血酸添加劑定量檢測研究

王曉彬，張 茜，關晨至，洪華秀，黃雙根，趙春江

1. 南昌師范學院物理與電子信息學院，江西 南昌 330032 2. 江西農業大學現代農業裝備重點實驗室，江西 南昌 330045 3. 國家農業智能裝備工程技術研究中心，北京 100097

引 言

小麥是人類最主要的糧食作物之一，全世界1/3以上的人口以它為主糧。面粉是小麥的主要加工品，常用于制作饅頭、面條、面包、方便面、水餃等食品。為滿足市場對不同面制品的需求，面粉生產企業需要在加工過程中配以各種添加劑，而添加劑的使用直接關系到面粉質量的優劣及消費者的飲食安全[1]。抗壞血酸亦稱維生素C，是一種中速氧化劑，可用于面粉品質的改良。在加入面粉中進行攪拌時，抗壞血酸被面粉中的部分氧化酶及空氣中的氧氣氧化變為脫氫抗壞血酸，其在面粉中發揮氧化作用，將—SH基氧化為—S—S鍵從而增加面筋筋力、改善面團性質[2-3]。抗壞血酸因其自身及分解物的無毒無害性而被各國允許加入面粉中，我國現行標準GB 2760—2014限定其在面粉中最大使用量為200 mg·kg-1。目前，面粉中抗壞血酸的常規檢測方法主要以高效液相色譜為主，該方法具有檢出限低、特異性強、靈敏度高等優點，但其需要溶劑提取、離心凈化和濾膜過濾等一系列前處理過程，程序復雜、檢測時間長、成本高，并且對樣品具有破壞性，不適于現場的快速檢測。

隨著光電技術的發展，一些光譜方法在面粉添加劑的檢測中展示了良好的應用前景，如近紅外光譜法[4-6]、太赫茲光譜法[7]和拉曼光譜法[8-9]等。但這些方法均是對樣品局部信息的獲取，存在取樣代表性問題； 此外，獲得的信息中僅包含樣品的光譜信息，無法獲取樣品內部物質的分布信息。拉曼成像技術融合拉曼光譜和數字成像技術的優勢，在對樣品掃描過程中可同時獲取拉曼信息和空間分布信息[10-11]。目前，拉曼圖像的獲取主要有三種形式： 點掃描、線掃描和面掃描，其中線掃描方式檢測速度優于點掃描方式，可較好的應用于平整樣品的檢測，在粉末狀食品的質量安全檢測中展示出良好的應用前景。目前，采用拉曼成像技術對面粉中添加劑的檢測以過氧化苯甲酰(增白劑)為主[12-14]，這些報道均提供了面粉中過氧化苯甲酰的空間分布及定量檢測模型，但其數據處理方法均是通過選擇添加劑單一拉曼特征峰對應的單波段校正圖像進行閾值分割生成二值圖像實現的，但一些添加劑(如抗壞血酸)的拉曼光譜中拉曼峰數量較多且強度差異較小，此時需考慮各波段對檢測結果的影響，因此本文基于偏最小二乘模型(partial least squares，PLS)回歸系數對樣品拉曼圖像中抗壞血酸添加劑的定量檢測進行了探討。

本研究采用拉曼成像技術獲取面粉中含抗壞血酸添加劑樣品的拉曼圖像，將PLS模型的回歸系數應用于面粉-抗壞血酸混合樣品拉曼光譜的所有波段，結合閾值分割實現拉曼圖像中面粉像素和抗壞血酸像素的分類，建立抗壞血酸濃度和抗壞血酸像素點數之間的線性關系模型，為面粉中抗壞血酸添加劑的定量檢測提供方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

線掃描拉曼成像系統，主要由以下部件組成： 785 nm線激光器，美國Innovative Photonic Solutions公司； 785 nm分光片，美國Semrock公司； InSpector R10E型光譜儀，芬蘭SPECIM公司； iKon-MDU934P-BEX2-DD型CCD相機，英國Andor公司。FA2204B型電子天平，上海精密科學儀器有限公司； Vortex-Genie2型渦旋混合器，美國Scientific Industries公司； 定制方形鋁合金容器，內部尺寸為45 mm×45 mm×2 mm； 50 mL離心管，購于北京東南儀誠實驗室設備有限公司。抗壞血酸，99%，購于東北制藥集團股份有限公司。面粉，超市購買，采用GB 5009.86—2016國家標準中高效液相色譜法進行測定未檢出抗壞血酸。

1.2 樣品制備

利用電子天平準確稱取0.02 g抗壞血酸和9.98 g面粉，裝入50 mL離心管中通過渦旋混合器混合均勻，獲得面粉中含0.20%抗壞血酸的混合樣品。以相同的方式，在保持每種混合樣品總質量為10 g的前提下，調整抗壞血酸和面粉的質量，制備面粉中含6種不同濃度抗壞血酸(0.01%，0.02%，0.05%，0.08%，0.10%，0.20%)的混合樣品。將制備好的混合樣品轉入方形鋁合金容器中，使混合樣品充滿整個容器并使得樣品的上表面與容器的上平面保持平齊。經過稱量，方形容器中混合樣品的質量約為2.10 g，為使制備的10 g混合樣品得到充分利用，將每種混合樣品裝入4個相同的方形容器中，獲得每種混合樣品的4個子樣品。同時，制備純面粉樣品和純抗壞血酸樣品，分為4個子樣品采集拉曼圖像。

1.3 拉曼圖像采集

將制備好的混合樣品放置于成像光譜儀鏡頭下方的單軸移動滑臺上，調整滑臺高度，使樣品表面與鏡頭的距離為20 cm，設定樣品采集的起始位置及結束位置。線掃描拉曼成像參數： 相機曝光時間1 000 ms，拉曼光譜采集范圍785～1 000 nm(對應拉曼位移0～2 728 cm-1)，光譜分辨率為0.54 nm，空間分辨率為0.125 mm·pixel-1，單軸移動滑臺的移動速度為0.082 3 mm·s-1。相機的采集區域為128 mm×45 mm，數據被保存為1 024×360×512的拉曼圖像立方體。

1.4 數據處理

為減少數據量提高有效信息的獲取效率，首先確定拉曼圖像的感興趣區域(region of interest，ROI)及光譜范圍。在方形樣品區域內，以其中心作為ROI的中心，選擇40 mm×40 mm的方形區域(對應像素點為320×320，共102 400個像素)，以確保只包含樣品區域，排除背景區域的影響。抗壞血酸拉曼峰主要集中于400～2 000 cm-1，因此選擇該光譜范圍用于后續的分析。激光和樣品相互作用，產生拉曼信號的同時還伴有熒光信號，較高的熒光背景信號對拉曼峰的識別產生極大的干擾，本文采用自適應迭代重加權懲罰最小二乘(adaptive iteratively reweighted penalized least squares，airPLS)方法實現拉曼光譜的基線校正。

建立混合樣品中添加劑濃度與拉曼圖像中各像素點拉曼光譜之間的PLS模型，其中校正集為不同濃度混合樣品的平均拉曼光譜，驗證集為面粉平均拉曼光譜和抗壞血酸平均拉曼光譜的組合光譜，通過式(1)實現

(1)

I=R1X1+R2X2+…+RnXn+R0

(2)

式(2)中：I為計算得到的強度值；R1—Rn為PLS模型中每個波段對應的回歸系數；X1—Xn是拉曼光譜中各波段對應的強度值；R0為截距。

2 結果與討論

2.1 抗壞血酸和面粉的拉曼光譜解析

圖1 (a)抗壞血酸和(b)面粉的平均拉曼光譜Fig.1 Average Raman spectra of (a) ascorbic acid and (b) flour

2.2 面粉-抗壞血酸混合樣品的拉曼光譜分析

圖2所示為面粉-抗壞血酸混合樣品的平均拉曼光譜。由圖1可看出，在各拉曼光譜中既包含面粉的拉曼信號又包含抗壞血酸的拉曼信號，但抗壞血酸的拉曼信號相對于面粉是十分微弱的，這是因為混合樣品中僅含有微量的抗壞血酸。在混合樣品的拉曼光譜中，僅有抗壞血酸的3處拉曼特征峰(631，1 128和1 658 cm-1)可觀察到。在0.20%濃度的混合樣品中，抗壞血酸的3處顯著拉曼峰強度最高； 當抗壞血酸濃度從0.20%降低到0.01%時，其拉曼強度不斷降低且不容易觀察。因此，本研究對拉曼圖像中各像素點對應的拉曼光譜進行評估，以實現面粉中抗壞血酸的有效檢測。

圖2 面粉-抗壞血酸混合樣品的平均拉曼光譜Fig.2 Average Raman spectra of flour-ascorbic acid mixed samples

2.3 PLS模型的建立

圖3 PLS模型的回歸系數Fig.3 Regression coefficients of PLS model

2.4 面粉中抗壞血酸的定量分析

PLS模型中回歸系數絕對值應用于混合樣品圖像中各像素點對應的拉曼光譜波段，通過式(2)計算得到像素點對應的強度值，將三維拉曼圖像轉換為二維灰度圖像。在混合樣品的灰度圖像中，面粉和抗壞血酸的像素點仍然難以識別，采用閾值分割方法將灰度圖像轉換為用于分類面粉像素和抗壞血酸像素的二值圖像。閾值同樣采用PLS模型回歸系數進行確定，即將回歸系數絕對值通過式(2)用于面粉拉曼圖像各像素點的拉曼光譜中，像素點強度的最大值為0.233 7，該數值確定為閾值。基于該閾值，在抗壞血酸的圖像中也沒有發現分類為面粉的像素，同樣在面粉的圖像中沒有發現分類為抗壞血酸的像素，表明該閾值可正確分類面粉像素和抗壞血酸像素。

在不同濃度的混合樣品中，高于該閾值的分類為抗壞血酸，以黑色像素表示； 低于該閾值的分類為面粉，以白色像素表示。圖4所示為混合樣品的分類圖像。在最低濃度0.01%的混合樣品中仍可觀察到黑色像素(抗壞血酸)，說明該方法對面粉中抗壞血酸的最低檢測濃度為0.01%。隨著抗壞血酸濃度的增加，混合樣品中檢測到的抗壞血酸像素點數量不斷增加； 在0.20%濃度的混合樣品中，檢測到的抗壞血酸的像素最多為228個，最少為212個，4個子樣品的平均像素數為221個。同一濃度樣品，檢測到的抗壞血酸像素點數量不同是由混合物中抗壞血酸顆粒的隨機分布引起的。此外，像素點數量的差異性，說明需要使用多個子樣本對混合樣品進行定量分析。

圖4 混合樣品的分類圖像Fig.4 Classification image of mixed samples

為計算不同濃度混合樣品的檢測結果，統計分類圖像中抗壞血酸像素點的數量。表1所示為混合樣品圖像中抗壞血酸的檢測結果。由表1可看出，隨著混合樣品中抗壞血酸濃度的升高，檢測到的抗壞血酸像素點數量不斷增加，以平均值代表該樣品的像素點數量，建立兩者之間的關系模型，如圖5所示，圖中混合樣品中抗壞血酸濃度同檢測到抗壞血酸像素點的平均值之間具有良好的線性關系，決定系數為0.996 0，表明拉曼成像技術可用于定量分析面粉中抗壞血酸添加劑。

表1 混合樣品圖像中抗壞血酸的檢測結果Table 1 Detection results of ascorbic acid in mixed sample images

圖5 抗壞血酸濃度與抗壞血酸像素點之間的線性關系模型Fig.5 Linear relationship model between the concentration of ascorbic acid and its detection pixels

3 結 論

通過線掃描拉曼成像技術實現了面粉中抗壞血酸的檢測、識別和定量分析。抗壞血酸的拉曼光譜中拉曼峰數量較多且存在強度相近的3處顯著拉曼峰，不便于采用單一顯著拉曼特征峰對應的灰度圖像識別抗壞血酸像素。為考慮各波段對檢測結果的影響，建立PLS模型并將回歸系數用于樣品圖像的重建，灰度圖像結合閾值分割方法實現了面粉-抗壞血酸混合樣品中面粉像素和抗壞血酸像素的分類。該方法對面粉中抗壞血酸的最低檢測濃度為0.01%(100 mg·kg-1)，在0.01%～0.20%的濃度范圍內建立了抗壞血酸濃度同檢測到的抗壞血酸像素點數量之間的線性關系模型，決定系數為0.996 0。同面粉中添加劑的其他光譜檢測方法相比，線掃描拉曼成像技術具有檢測面積大、可視化識別和易于操作的優點。研究結果可為面粉添加劑的無損定量檢測提供方法支持，為現場快速檢測設備的開發提供了理論基礎。