運脾豁痰通腦方對腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠神經和胃腸功能、生長激素釋放肽和小窩蛋白1表達的影響▲

劉永輝 高玉廣 卿 潔 譚慶晶 吳 鵬 王天保 韋甜露 劉 泰 陳 煒

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院腦病二區，南寧市 530023，電子郵箱：liuyonghui626@126.com)

急性腦血管疾病患者起病后可以發生多個器官功能損傷，其中胃腸道動力功能障礙是腦缺血再灌注后的常見表現。腦缺血再灌注后腸道的屏障功能受損，消化道潰瘍、出血的發生率升高[1]。此外，胃腸功能損傷可加重原有腦部病灶的損傷，并可影響機體各器官功能[2]。目前，腦缺血再灌注后胃腸功能損傷的治療主要包括改善神經功能、調節和保護胃腸功能，但是大部分患者仍出現神經功能缺損的后遺癥，需要長期留置胃管鼻飼，生活質量嚴重下降，需要長期陪護治療，這加重了家庭負擔。因此，尋找腦缺血再灌注后胃腸功能損傷的有效治療靶點對改善此病的預后意義重大。近年來，“腦腸同治”以及“腦-腸軸”理論備受關注，故本研究采用運脾豁痰通腦方(自擬方)治療腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠，探討該方的神經保護和胃腸功能調節作用，并檢測相關組織中生長激素釋放肽(Ghrelin)、小窩蛋白1的表達水平以探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠90只，清潔級，體重(440±20)g，20～21月齡，由廣西醫科大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK桂2009-0002)。所有大鼠在溫度為21℃～24℃、濕度為45%～55%的環境中飼養，實驗前適應性飼養1周,并隨意進食和飲水。

1.2 主要試劑及藥物 蛋白免疫印跡實驗一抗稀釋液(碧云天生物公司，批號：P0023A)，內參Mouse Anti-β-Actin(博士德生物，批號：AC-15)，BeyoECL Plus超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物公司，批號：P0018)，凝膠制備試劑盒(碧云天生物公司，批號：P0012AC)，十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)蛋白上樣緩沖液5X(博士德生物，批號：AR1112)，RIPA裂解液 (碧云天生物公司，批號：P0013B)，Ghrelin抗體(Abcam公司，批號：ab95250)，小窩蛋白1抗體(Abcam公司，批號：ab32577)。運脾豁痰通腦方(茯苓12 g、青皮10 g、黃芩15 g、膽南星5 g、石菖蒲15 g、皂莢10 g、地龍10 g、丹參15 g)為江陰天江藥業有限公司的免煎顆粒(規格：5 g/包)。

1.3 主要儀器 電子分析天平(OHAUS公司，型號：AR2140)，轉印儀(長沙市三環電子設備廠，型號：Mini-PROTEAN)，微型超速冷凍離心機(德國貝克曼庫爾特公司，型號：BEA21)。

1.4 分組及模型制備

1.4.1 分組：根據SPSS 17.0軟件產生的隨機數字進行分組，分為假手術組(30只)和缺血再灌注后胃腸損傷組(60只)。

1.4.2 大鼠大腦中動脈閉塞模型：大鼠術前禁食、禁水12 h。通過腹腔注射10%水合氯醛(35 mg/kg)麻醉大鼠，然后將其仰臥位固定。對于缺血再灌注后胃腸損傷組大鼠，分離雙側頸總動脈后使用動脈夾關閉，阻斷血流3 min后打開動脈夾使血流再灌注；對于假手術組大鼠，僅單純分離雙側頸總動脈。

1.4.3 腦缺血再灌注后胃腸損傷模型：大腦中動脈缺血再灌注24 h后，再根據是否出現異常胃腸表現篩選腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠(此時為造模成功)。異常胃腸表現包括大鼠被毛失去光澤，豎毛，大便逐漸變軟，逐漸出現食量下降，體重減輕；大便稀軟，不成形，甚至溏瀉，肛周、尾根部污穢，或干或濕，被毛枯黃或散亂，貼邊，扎堆，對外界反應遲緩。缺血再灌注后胃腸損傷組的60只大鼠均出現上述表現，將其采用隨機數字表法分為模型組、中藥組各30只。

1.5 干預方法 造模成功后自由飲水及進食，3 d后開始進行干預。(1)中藥組：以純凈水為溶媒，將運脾豁痰通腦方制成等質量混懸液，按每次380 mL/kg進行灌胃， 1次/d，共14 d。(2)假手術組和模型組：給予灌胃蒸餾水(0.38 mL/kg)， 1次/d，共14 d。灌胃結束后，對各組大鼠進行神經功能缺損評分，然后斷頭處死大鼠，剝離下丘腦、胃、結腸并迅速放入凍存管內，-196℃液氮中凍存備用。

1.6 觀察指標

1.6.1 各組大鼠胃腸功能評估：灌胃期間記錄各組大鼠每日飲食量、腹瀉的次數，并記錄灌胃結束后的體重，以評估大鼠的胃腸功能。

1.6.2 各組大鼠的神經功能缺損評分：使用ZeaLonga 5分制標準[3]。其中，0分為無神經缺失癥狀，1分為不能伸展對側前爪，2分為行走時向偏癱側轉圈，3分為向偏癱側傾倒，4分為不能自發行走、意識喪失。

1.6.3 免疫印跡法檢測大鼠腦組織的小窩蛋白1表達水平和胃組織的Ghrelin的表達水平：取出大鼠腦、胃組織，分別采用RIPA裂解液進行裂解，勻漿，4℃下12 000 r/min離心5 min，去除沉淀，取上清液。在分光光度計上比色分析，制作標準曲線測出各樣本的蛋白濃度。然后上樣，電泳，用聚偏二氟乙烯膜60 V進行印跡轉移2 h。封閉液封閉1 h后，加入相應的一抗過夜(一抗稀釋濃度均為1 ∶100)。次日漂TBS液洗膜3次后，加入二抗(稀釋濃度為1 ∶100)。加入發光液，膠片顯像，用Image J軟件分析圖像，實驗以β-actin為內參。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠胃腸功能指標的比較 與假手術組相比，模型組、中藥組大鼠的體重降低、飲食量減少、腹瀉次數增加(均P<0.05)；與模型組相比，中藥組的體重、飲食量均增加，而腹瀉次數減少(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠胃腸功能指標的比較(x±s)

2.2 各組大鼠神經功能缺損評分的比較 假手術組無神經功能缺損，模型組和中藥組的神經功能缺損評分高于假手術組(P<0.05)，而中藥組的評分低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠神經功能缺損評分的比較(x±s)

2.3 各組大鼠腦組織中小窩蛋白1的表達和胃組織中Ghrelin的相對表達 模型組和中藥組的小窩蛋白1和Ghrelin相對表達水平均高于假手術組 (均P<0.05)；中藥組的小窩蛋白1相對表達水平低于模型組，而Ghrelin相對表達水平高于模型組(均P<0.05)。見表3。

表3 3組腦組織小窩蛋白1和胃組織Ghrelin相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

中醫認為卒中后胃腸損傷屬于“呃逆”“胃脘痛”“虛秘”和“泄瀉”。而卒中病為痰濁阻于中焦，升降失常，致腦脈阻滯不通。老年人脾失運化，痰濁內生，內虛生風，風痰阻絡，腦竅不開，致使卒中，卒中后胃氣失和、氣機不暢、運化失調，引起“呃逆”“胃脘痛”“虛秘”“泄瀉”。故疏通經絡，健脾推行氣血，豁痰開竅是主要治療原則。本研究選用由茯苓、青皮、黃芩、膽南星、石菖蒲、皂莢、地龍、丹參制成的運脾豁痰通腦方，觀察其對腦缺血再灌注后胃腸道功能障礙的改善作用。結果顯示，與假手術組相比，模型組神經功能缺損評分升高，體重降低、飲食量減少、腹瀉次數增加(P<0.05)，提示成功建立腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠模型。給予運脾豁痰通腦方干預后，與模型組相比，中藥組的神經功能缺損評分降低，體重和飲食量減少，而腹瀉次數減少(P<0.05)。結合運脾豁痰通腦方中，青皮可抑制胃腸道平滑肌收縮[4]，黃芩的主要藥物成分除有抗炎作用,還能增強神經細胞的活力,提高神經細胞的存活率,對腦卒中后腦部神經修復起積極作用[5]；膽南星、石菖蒲、皂莢三藥均有祛痰開竅作用,皂莢可通絡,石菖蒲還有抗抑郁、營養腦部神經的作用,現代藥理研究表明,這三藥均有針對心腦血管的作用[6-8]；地龍、丹參活血通經,其中丹參有較強的清除自由基的作用,能有效保護胃腸黏膜,且其有效成分丹酚酸B有較好的腦保護作用[9]。因此，運脾豁痰通腦方不僅可以減輕腦缺血再灌注引起的神經功能損傷，還可改善胃腸道功能。

小窩蛋白1是胞膜窖的標志性蛋白，在調節血腦屏障功能中具有重要作用。目前已明確小窩蛋白1與卒中發生后的血腦屏障滲透性密切相關。Choi等[10]發現，大腦中動脈閉塞3 d后大鼠腦組織中小窩蛋白1的表達水平和血腦屏障破壞均達到峰值；認為小窩蛋白1表達水平與缺血引起的血管源性腦水腫密切相關，其在腦缺血損傷期間調節血腦屏障通透性中有重要作用。另有臨床研究表明，發病后8 h、24 h、48 h、72 h、1周，腦室出血患者腦脊液中小窩蛋白1水平顯著升高，且腦內小窩蛋白1的表達與顱腦損傷的嚴重程度有關，其或可作為顱腦損傷疾病預后的指標[11]。本研究結果也顯示，腦缺血再灌注后胃腸道損傷的大鼠腦組織的小窩蛋白1表達水平升高；而給予運脾豁痰通腦方干預后，中藥組大鼠腦組織的小窩蛋白1表達水平低于模型組(P<0.05)。有學者發現，降低小窩蛋白1的表達可改善腦缺血再灌注損傷大鼠的血腦屏障[12]。因此，推測運脾豁痰通腦方可能通過調節小窩蛋白1的表達來改善血腦屏障的功能，從而減輕大鼠的腦缺血再灌注損傷。

Ghrelin是主要由胃基底部黏膜層X/A樣細胞分泌的一種新型腦腸肽激素，其結構與胃動素相似，還可廣泛表達于胃黏膜之外的器官或組織，如腦、腸等。除了促進生長激素分泌，Ghrelin還具有促進食欲和進食活動、促進胃酸分泌和胃蠕動等生理作用[13]。有研究顯示，外源性Ghrelin可以改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經功能缺損，縮小梗死面積，并提高皮質層神經元的存活率[14-15]。本研究中，模型組大鼠胃動力學降低的同時胃組織Ghrelin水平升高。有學者也發現，腦缺血大鼠在腦缺血早期胃動力學顯著降低而血清Ghrelin水平升高，這可以解釋為早期缺血階段的代償反應[16]。本研究中，給予運脾豁痰通腦方干預后，中藥組大鼠腦組織的Ghrelin表達水平高于模型組(P<0.05)，這表明運脾豁痰通腦方可上調Ghrelin水平。血清Ghrelin的上調可預防腦損傷并增加腸道蠕動，從而減少胃黏膜屏障的損傷[17]。此外，Ghrelin還可通過調節活性氧、酶活性和線粒體基因表達來抑制細胞凋亡，在腦缺血再灌注損傷中具有顯著的細胞保護效應[18]。因此，我們推測運脾豁痰通腦方通過上調Ghrelin水平，從而調節活性氧、酶活性和線粒體基因表達來抑制細胞凋亡，進而增加腸道蠕動，并減輕血腦屏障的破壞和腦缺血再灌注損傷。

綜上所述，運脾豁痰通腦方不僅可以減輕腦缺血再灌注后胃腸損傷大鼠的神經功能損傷，還可改善胃腸道功能，其可能通過下調小窩蛋白1、上調Ghrelin的表達來發揮治療作用。