TLRs信號通路在干眼發病機制中的研究進展

李寶花，寧博彪，魏宇嬌，唐雪鳳，葛惠玲，馬芬俞

0引言

國際干眼共識(TFOS DEWS Ⅱ)的定義和分類小組重新定義了干眼的概念：干眼(dry eye disease，DED)是眼表的一種多因子疾病，特征是淚膜穩態的喪失并伴有眼表癥狀，其病因包括淚膜不穩定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷和神經感覺異常[1]。DED主要臨床表現為眼睛異物感、干澀感、燒灼感、畏光、視物模糊和視疲勞。DED所造成的社會經濟負擔和對個人視力、生活質量和生產力產生的不利影響以及疼痛對身體和心理的影響都是值得思考的。明確干眼的發病機制，對于干眼的防治顯得尤為重要。越來越多的研究表明，炎癥在干眼發病機制中起著至關重要的作用，因此干眼的炎癥機制及抗炎治療已成為近年研究的熱點。相關研究顯示Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)及其信號系統表達的調控在干眼的炎癥反應過程中發揮了重要作用[2-3]。本文總結近10a來有關TLRs對干眼免疫應答的研究，探討通過對TLRs信號通路的調節及控制以達到對干眼的治療及預防。

1 Toll樣受體及其信號轉導通路

Toll樣受體是先天免疫系統的模式識別受體，可識別高度保守的微生物結構和產物[4]。目前，15種TLRs已被人類發現，TLR1～TLR9為人鼠所共有，TLR10只存在于人類，TLR11、TLR12及TLR13只存在于鼠類，TLR14以及TLR15已經在鼠與雞內有所發現，也有人認為TLR14為人、鼠共有[5]。

1.1 TLRs的組織結構TLRs家族是一個高度重合的同源家族，其基本的結構組成包括3個部分，分別為：胞外區、跨膜區和胞內區。十余個含有亮氨酸的堿基重復序列相連接而構成胞外段，MD-1、MD-2和RP105是其重要的輔助蛋白，胞外段的主要作用就是識別與其相應的配體，來傳遞其所需要傳遞的信息。胞內段的主要亮點在于髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)，MyD88是一種用來轉換以及傳達信號的蛋白，參與著TLRs的信號傳遞，以完成整個信號通路的信息傳導[6]。

1.2 TLRs的微生物配體正如上面所提到的，胞外段的主要作用就是識別與其相應的配體，故而因其TLRs的不同，與其相應的配體也分別各有差異。TLR1，2，4，5，6和10的識別受體通常顯示在細胞表面上，與其相應的配體相結合；而TLR3，7，8和9通常位于細胞內的內體膜上，因為它們的天然配體可能僅存在于細胞的酸性區室中[7]。特定的TLRs結合相應的特意性配體，如：TLR3識別病毒的雙鏈dsRNA；TLR5識別細菌鞭毛蛋白；TLR6主要與TLR2協同作用識別細菌的PGN和脂肽；TLR7和TLR8對病毒性單鏈RNA起反應；TLR9可介導對細菌CpGDNA的胞內反應。

1.3 TLRs信號轉導通路每一個TLRs家族成員必須依賴于Toll樣受體特定的組成結構向相應的細胞轉導表達的信息，與其特有的轉接蛋白相接觸，核轉錄因子NF-κB、絲裂原蛋白激酶(MAPK)p38、IFN誘導因子等被激活、傳遞信息，操縱的特定基因激活并表達。MyD88、MyD88-轉接體樣/TIR-相關蛋白(MAL/TIRAP)、Toll受體相關分子(TRAM)、誘導IFN-β的含TIR結構域轉接體(TRIF)和SARM，這5種轉接蛋白，參與著TLR信號轉導通路的表達。其中，MyD88和TIR結構域轉接體能夠激活下游酶，其特有的酶鏈反應激活信號通路的表達，而Toll受體相關分子和MyD88-轉接體樣/TIR-相關蛋白，其作用機制是轉運髓樣分化因子88以及TIR結構域轉接體，同樣誘導TLRs信號轉導通路，接頭蛋白SARM則與TLRs信號通路的負調節有關。

上面所說的特異性接頭蛋白，將TLRs信號轉導通路的轉導途徑分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑，也是其最根本的轉導方式[8]。MyD88依賴性途徑是大多數的信號轉導途徑。其中某些Toll樣受體胞外段識別與其相應的配體結合以后，直接作用于髓樣分化因子88，比如TLR5、TLR7、TLR8和TLR9；而TLR4、2不能直接作用于髓樣分化因子88，中間要先形成二聚體、結合橋梁接頭蛋白Mal，才可以發揮轉接作用。整個途徑所活化及磷酸化的因子及化合物有TAK1、IKK復合物及IkB，IkB降解以后，NF-κB才能轉位至細胞核，誘導腫瘤壞死因子-α活化，完成炎癥反應的整個過程。髓樣分化因子88的非依賴途徑很少被利用，只有TLR3、專門修飾后的TLR4以及TLR5所利用，誘導腫瘤壞死因子-β活化，同樣誘導炎癥反應的最終表達[9]。

以TLR4為例，TLR4不但能激活髓樣分化因子88依賴途徑，而且還能激活髓樣分化因子88的非依賴途徑。MyD88依賴途徑：TLR4與特異性配體相結合以后，與橋梁接頭蛋白Mal相結合以后，與髓樣分化因子88的一端相結合，而另一端與白介素受體酶1和2相結合，并使其磷酸化，然后激活TNF6，活化TAK1，IkB磷酸化并降解，活化髓樣分化因子88，轉位在細胞內，誘導白介素1、6、8等炎癥因子的免疫應答反應，從而使炎癥發生[10-11]。MyD88非依賴性信號轉導途徑：髓樣分化因子88不被激活，主要是通過激活β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adapter-inducing inter feron-β，TRIF)完成的，其過程也是活化NF-κB活化因子以及其它炎癥因子，而激發炎癥反應[12-13]。

2 TLRs及其信號通路在干眼中的表達

干眼是以淚膜穩定性失常為主要特點，伴有眼部干澀感、異物感、眼紅、酸澀感等癥狀的眼表炎癥疾病，近些年的研究將干眼的作用機制主要關注于：淚膜穩態失常、淚液高滲透性以及局部炎癥反應[14]。隨著環境污染加劇、電子產品的大規模運用以及社會壓力的不斷增加而導致不良的生活作息及飲食失宜的不斷加劇，使干眼發病的腳步進一步加快。發病率不斷升高的干眼危及著越來越多的人類生活，輕者影響生活質量，重者導致患者角膜上皮的缺損、角膜發生新生血管、角膜翼障、角膜的損傷、視力下降甚至失明。

干眼的發病因素復雜，炎癥作為干眼不可推卸的責任，有待我們進一步思考，眼表的高滲透性與炎癥反應不斷地刺激眼表的穩態，炎癥的不斷刺激，眼表的神經末梢受損，對外界的刺激越來越不敏感，進而瞬目減少，加重干眼患者的眼表不適感進一步加重，成為惡性循環，尋求其最根本的作用機制已經成為大勢所趨，相應的抗炎治療引起越來越多的熱議[15-17]。目前眾多實驗已經證明與眼表炎癥相關的因子有很多[18-24]，比如白細胞介素：IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、IL-1β，腫瘤壞死因子：TNF-α、TNF-β，Toll樣受體：TLR2、4、9，核轉錄因子-κB(NF-κB)等。

干眼患者眼表的免疫調節機制紊亂，眾多研究已經表明，TLRs及其信號系統的表達在干眼的炎癥反應過程中發揮了重要作用，其信號通路的高度表達，誘發并加重其炎癥的表達[25]。所以，與之相關的研究應當重視其通路的作用機制，探究其與干眼的高度相關性，為干眼的診斷及治療尋找更有效且長久的理論依據。

2.1 TLRs在干眼相關組織中的表達干眼所參與的功能單位主要涉及到淚膜、角膜、結膜、淚器(主要是淚腺)、瞼板腺等。這些組織對于保證淚液的正常分泌，以及維持眼表的正常潤澤，保證正常的視物功能，有著重要的作用。其中任一組分的損害均可導致淚膜穩態的喪失，而淚膜的持續異?？蛇M一步引起上述功能單位中其他組分的病理改變，進而導致干眼的發生[26-29]。綜上所述，各種原因導致的角膜上皮的缺損，角膜的新生血管、角膜翼障、角膜的損傷以及角膜瘢痕等不僅可以導致干眼，也可以互為因果、相互加重。

2.1.1 TLRs在角膜中的表達Rachel等已經證明Toll樣受體在干眼中高度表達，給予高滲透環境，檢測角膜上皮細胞中的TLR4、TLR9均有所表達，而TLR5 mRNA則無表達，TLR4增加8.18倍，TLR9減少0.58倍；給予干燥環境，發現TLR4和TLR5 mRNA均上調、TLR9 mRNA則下調，其相應的表達分別為4.81、2.51、0.86倍[30]。Lee等[4]研究結果表明干眼的炎癥由TLR4信號通路所誘導，其水平與干眼的嚴重程度呈現正相關。Chinnery等[31]研究了上皮清創術后小鼠TLR9配體誘導的角膜炎癥的機制，結果數據顯示局部應用CpG寡脫氧核苷酸(ODNs)，可以使TLR9活化而誘導眼內炎癥，ODNs除可以誘導干眼以外，還可誘導其它炎癥。Li等[3]研究顯示，TLR4存在于正常人的角膜內，當炎癥增加時，其水平隨著干眼的程度升高。周芳等[32]研究大鼠角膜堿燒傷早期炎癥反應的動物實驗中，結果顯示TLR2、TLR4不僅參與了角膜堿燒傷的炎癥反應，而且還誘導并促進其加重。以上數據均表明角膜中表達Toll樣受體，而且在炎癥來臨時Toll樣受體發揮出至關重要的作用。

2.1.2 TLRs在結膜和淚腺中的表達Micera等[33]已經證實了TLR4、TLR9參與了春季角膜結膜炎的發生，導致結膜上皮中TLR4轉錄調節和TLR9轉錄下調。Reins等[34]證實干眼眼表結膜中TLR2、4、9表達，以及淚腺中TLR5表達均有不同程度的增加。Barabino等[2]研究顯示干眼患者的眼表損害伴著TLR9表達的上調，進一步證明TLR信號通路參與著干眼的眼表炎癥。Rachel等研究干眼炎癥中TLRs和抗微生物肽(AMP)的表達[35]。結果實驗性干眼上調瞼結膜中的TLR2、3、4和9 mRNA表達，并且發現在角膜上皮中也發生了TLR2、3和9 mRNA的表達，同時發現淚腺中TLR2、TLR5有所上調，總體而言，TLRs蛋白有相應的變化。楊青霞等[36]探討五羥色胺在攝取抑制劑引起干眼的潛在機制的實驗中，證明氟西汀可激活結膜上皮細胞中TLR2/NF-κB信號通路，進而抑制了干眼的眼表炎癥。

2.2 TLRs在干燥綜合征中的表達干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種慢性炎癥性自身免疫病。干燥綜合征其中最重要的臨床表現就是眼干、口干。Marie等以20例原發性干燥綜合征患者和20例健康對照者做實驗，并檢測外周血中TLR1-10蛋白及mRNA水平，結果發現SS患者TLR8 mRNA水平顯著高于對照組，而TLR9 mRNA水平顯著低于對照組，TLR5顯著減少，TLR7顯著增加[37]。Ainola等[38]用凋亡細胞培養基連續離心步驟收集的凋亡顆粒，對SS自身抗原在這些顆粒中的表達和定位進行了分析，結果表明雄激素保護細胞免受細胞凋亡，影響自身抗原的重新分布，并減少細胞凋亡刺激顆粒的增加。Nakamura等[39]研究了Toll樣受體等先天性免疫細胞，TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及TLR9參與誘導了SS患者的炎癥，TLR3還可以誘導SS患者唾液腺上皮細胞凋亡，從而導致干燥綜合征的產生。由此我們可以猜想這些信號通路對淚腺是不是也有相似的作用。

這些數據初步表明，干眼的發病機制之中，TLRs差異性參與表達，并提示TLRs參與干燥綜合征的炎癥反應，不論是SS型干眼還是非SS型干眼，其炎癥機制均與TLRs信號通路有密切的關系。目前尚不完全清楚其具體的機制及其結果。然而，無論病因如何，表達模式何如，更詳細的作用機制必將是研究的重點。

3不同干預方法對干眼TLRs通路的影響

3.1中藥對干眼TLRs通路的影響中醫以整體觀念為指導，注重辨證論治，強調調整恢復人體的整體陰陽平衡，眾多研究證明，中藥可以通過清熱解毒、滋陰、活血化淤等作用調節炎癥反應[40-42]。林崇澤等[43]觀察益氣養陰祛瘀中藥對干燥綜合征的影響，結果發現益氣養陰祛瘀中藥下調了血清TLR9表達，并且有效地緩解了眼睛干燥癥狀。黃綏心[44]觀察益氣養陰祛瘀方干預肥胖糖尿病自發性干燥綜合征的作用，結果表明TLR-IFN-BAFF信號通路參與了肥胖糖尿病自發性干燥綜合征的發生，并且益氣養陰祛瘀方下調TLR5、IFN-α、BAFF mRNA及蛋白的表達，并且有效地解決了小鼠的口干等癥狀。韋尼[45]通過觀察活血解毒方的作用機制，結果發現活血解毒方有效地增加了小鼠(NOD)的唾液分泌量，同時降低NOD小鼠血清TLR2、TLR4、CD14蛋白表達及頜下腺TLR2、TLR4、CD14 mRNA水平。孫會蘭[46]在研究逍生散顆粒劑對干眼小鼠模型角結膜組織TLR4及NF-κB影響的實驗中，實驗結果表明逍生散顆粒劑對小鼠干眼模型角結膜組織TLR4、NF-κB兩條通路均有抑制作用，進而加快干眼的癥狀緩解。

3.2針灸對干眼TLRs通路的影響上面談到中醫的治療優勢，而針灸可以改善病變局部的血液循環,疏通經絡，且副作用少、依賴性小、安全性高,是一種廣泛為大眾接受的綠色療法。毫針透刺法中的多種補瀉手法同樣可以實現所謂“消炎”之功[47]。張丹[48]觀察電針治療干眼的臨床療效，結果發現電針對TLRs/NF-κB信號通路有影響，并且很大程度緩解了干眼患者的癥狀，提高了生活質量。

3.3其它一些中成藥、西藥、靶向藥等藥物的抗炎機制也是不可忽略的。Putranto等開發了RAGE肽抑制劑，在聚乙烯亞胺陽離子的作用下，傳遞于細胞內，該肽與TLR-IL-1受體域結構銜接蛋白相結合，進一步阻斷了眼表炎癥的發生[49]。付榮嶸[50]的研究表明瑞巴派特對小鼠的結膜及淚腺中炎癥具有抑制作用，其作用機制為抑制TLR4、MyD88、NF-κB的表達,從而阻止其炎癥反應。

4結論與展望

近年來有關干眼的治療方法層出不窮，不可否認的已經收到很多突破性的研究，但就其發病率高及其現有的治療方法并未將其完全治愈引來越來越多的臨床工作者熱議，近年來干眼的炎癥機制及抗炎治療已成為研究的熱點，眾多的研究已經證明，TLRs信號轉導途徑是干眼炎癥發生的重要機制，及其信號通路的調控在干眼的炎癥反應過程中發揮了重要作用。干眼的發生主要依賴于Toll樣受體上特異性接頭蛋白，將TLRs信號轉導通路的轉導途徑分為MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑。

目前認為炎癥是干眼發病的核心。TLRs在介導干眼的免疫應答、誘導多種炎性因子生成、啟動獲得性免疫應答中發揮重要的作用。TLRs在干眼相關組織角膜、結膜、淚腺、瞼板腺中均有表達，TLRs在干燥綜合征外分泌腺、唾液腺有相應的表達，故TLRs參與非SS和SS干眼的病理生理學。通過調控TLR信號通路治療干眼可能是中藥、針灸、瑞巴派特及RAGE肽抑制劑等治療方法的作用機制之一。

然而，目前的研究對于TLRs及其信號系統的了解還不夠深入，除去目前已經發現的15種TLRs外，是否還有更多的TLRs未被人類所知道；除去所發現的MyD88依賴性途徑和MyD88非依賴性途徑以外，是否還有其它的TLRs信號通路的表達途徑也是現有的技術未知的；TLRs家族成員之間有沒有必然的聯系，聯系的機制是怎樣的并未充分證明；藥物通過該信號通路作用于干眼的整個途徑中，從上游到下游所參與的所有因子的表達也不夠詳盡。此外，中醫藥運用于干眼的臨床使用的方式也十分局限，目前的相關研究中多以中藥湯劑為主，雖然取得了一定程度上的療效，但缺乏其他有效手段如針灸、拔罐、按摩等的相關研究，導致中醫藥對于干眼的預防、治療等方面整體辨證、治病求本的優勢還遠未發揮出來。這些問題亟需大量的研究來證明、解決。