TRPM3/miR-204復合位點調控眼部疾病的研究進展

張瑞雪，何 媛

0引言

眼部疾病復雜多樣，隨著對其發病機制的不斷深入探究，基因預防和基因治療逐漸成為研究熱點之一。瞬時受體電位(TRP)通道蛋白是細胞膜上的一類非選擇性陽離子通道蛋白家族，TRPM3是TRP家族M亞家族中的一員，對鈣離子和鎂離子具有一定通透性。微小RNA(miRNA)是長約22個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中，通過對翻譯水平的抑制或斷裂靶mRNAs來調節基因的表達。目前發現上百種miRNA在眼組織中呈不同程度表達，并與多種眼部疾病的發生、發展密切相關，如血清中miR-23a和miR-34a表達上調通過促進炎癥和氧化應激反應從而參與年齡相關性黃斑變性(ARMD)的發生及發展；糖尿病視網膜病變(DR)患者血清miR-146a明顯降低，可能通過介導炎癥反應和血管增生參與DR的發病[1-2]。越來越多的研究表明，TRPM3/miR-204復合位點在眼組織的發育和眼部疾病的表達調控中發揮重要作用。本文就TRPM3/miR-204分子通路的生物學功能、在眼部的表達與調控及其與眼部疾病的相關性研究進展進行綜述。

1 TRPM3/miR-204

TRP陽離子通道超家族在細胞的感應、黏附、增殖、分化和凋亡等多種細胞過程中起重要作用。TRPM3是TRP家族M亞家族中成員之一，編碼質膜上的陽離子通道蛋白。TRPM3基因是位于人類9號染色體(9q21.11-q21.12)長臂上最大的基因之一，其長度超過0.9Mb[3]。有研究證實TRPM3的兩種錯義突變可導致人類遺傳性白內障[4]，Bennett等[5]初步研究發現TRPM3內含子2的基因突變與年齡相關性白內障相關。TRPM3的非編碼區突變與長壽、低密度脂蛋白及甘油三酯升高、系統性硬化癥、阿司匹林加重性呼吸系統疾病和甲狀腺結節有關[6-10]。而TRPM3編碼區變異可能導致智力障礙和癲癇[11]。TRPM3通道對溫度敏感，研究顯示其在傳感有害溫度、調節胰島素釋放和分泌炎性因子方面發揮一定作用[12-13]。

TRPM3含有非編碼miRNA基因，與宿主基因同方向共轉錄，通過對靶mRNAs的切割或抑制mRNAs翻譯參與轉錄后水平基因表達的調控。miR-204位于TRPM3內含子6上[14]，通過調控多種基因的表達增加TRPM3位點的功能復雜性。因此，miR-204的表達受TRPM3啟動子調控，也受表觀遺傳機制的調控[15]。miR-204與TRPM3轉錄方向相同[16]，有研究表明miR-204的表達模式也與TRPM3大致相同。如在眼部晶狀體、脈絡膜、視網膜神經元、睫狀體和視網膜色素上皮(RPE)細胞中可同時檢測到miR-204和TRPM3[16-21]。TRPM3和miR-204也在胰島素瘤細胞中共表達，miR-204可以調節胰島素的生成[22]。TRPM3在伴有VHL基因丟失的人腎透明細胞癌(ccRCC)的發生發展過程中也起重要作用，miR-204的直接靶點TRPM3在缺失VHL基因的腎透明細胞癌中表達增加[23]。Butrym等[24]發現位于miR-204上游側翼的基因突變可造成急性髓系白血病惡化。因此，了解不同特定的TRP通道/miRNA分子通路可能為疾病的靶向治療提供臨床依據。

2 TRPM3/miR-204在眼部的表達及調控

在人眼部，多個TRPM3轉錄變體存在于晶狀體中[5]，且成人RPE細胞系(ARPE-19)的TRPM3轉錄水平更接近原代RPE細胞[25]。RNA測序證實，TRPM3在人RPE組織、細胞系和晶狀體干細胞系中比視網膜或角膜源性細胞中更豐富[26-27]。許多學者在人睫狀體、小梁網(HTM)細胞、晶狀體上皮中檢測到miR-204轉錄[28-29]，miR-204可調節HTM細胞中多個基因的表達，蛋白質印跡分析顯示miR-204的直接靶點蛋白Bcl2l2、BIRC2、EZR、M6PR、SERP1表達水平均下調[29]。miR-204是睫狀體中表達含量最多的miRNA，也在角膜、小梁網等與青光眼和圓錐角膜相關的眼組織中表達[30]。TRPM3免疫定位于人胎兒RPE(hf-RPE)細胞的頂漿膜亞區，并富集于頂漿細胞緊密連接處和初級纖毛基底處[31]。小眼球畸形相關轉錄因子(MITF)參與TRPM3/miR-204分子通路的調控，在去分化的hf-RPE細胞中MITF和TRPM3/miR-204顯著下調，將前體miR-204轉染到hf-RPE細胞中，可促進細胞分化；而加入miR-204抑制劑則會導致細胞去分化。在hf-RPE細胞中，敲除MITF會降低TRPM3/miR-204及其他RPE分化基因(如TYR、TYRP1) 的表達，導致hf-RPE細胞去分化；相反，MITF和前體miR-204共轉染促進了hf-RPE細胞分化，這說明MITF介導的miR-204上調在促進hf-RPE細胞分化中起關鍵作用[32]。TRPM3/miR-204復合位點在眼組織中呈不同程度表達，且在多種眼部疾病的調控中也扮演重要角色。

3 TRPM3/miR-204與眼部疾病

3.1 TRPM3與白內障TRPM3是晶狀體發育和白內障形成的相關基因之一。Bennett等[5]首次證明TRPM3與人類遺傳性眼病有關，并定位于染色體9q上，進一步證明該陽離子通道在正常眼組織發育中的重要作用。人類9q染色體上的TRPM3是引起常染色體顯性遺傳性白內障和高眼壓性青光眼的發病基因。全外顯子測序和下一代測序技術檢測出TRPM3的外顯子3中存在與疾病共分離的A/G雜合轉變[5]；作為選擇性剪接的結果，這種錯義突變可能會導致TRPM3轉錄變體9上密碼子65的蛋氨酸被異亮氨酸替代，以及導致密碼子8在人晶狀體中表達一種新的TRPM3轉錄變體。對重組TRPM3-GFP熒光蛋白基因產物的瞬時表達研究顯示，I/M的替代引入了1個可變的翻譯起始位點，該位點位于其他8個TRPM3轉錄變體的蛋氨酸上游密碼子89上[5]。另外，在23例中國兒童散發白內障患者中也檢測到位于TRPM3外顯子29的錯義突變[33]。

3.2 miR-204與白內障研究表明，miR-204的異常表達可能導致晶狀體上皮細胞凋亡、晶狀體纖維細胞紊亂和晶狀體透明度降低，從而形成白內障[34]。miR-204的差異調控與年齡相關性白內障、先天性白內障、糖尿病性白內障和后發性白內障/后囊膜混濁(PCO)的形成相關[35-38]。在年齡相關性白內障手術患者中，miR-204-5p和miR-204-3p在晶狀體上皮中央表達下調超過2倍[37]。在PCO組織和晶狀體上皮細胞(LECs)中，miR-204-5p和miR-204-3p也顯著下調。原代LECs中miR-204-5p過表達導致鈣黏蛋白表達增加；而上皮間質轉化(EMT)標志物、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白表達減少。miR-204過表達直接作用于DNA結合蛋白SMAD4來加強抑制轉化生長因子-β2(TGF-β2)介導的EMT[38]。miR-204通過靶向TGF-β/SMAD信號通路而直接抑制EMT，可能成為治療PCO的新靶點。miR-204也與白內障氧化應激相關基因的調控相關。miR-204不僅抑制促氧化基因如硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP) 3’-UTR的轉錄，還激活了抗氧化基因如乙醛脫氫酶1A3(ADH1A3)的5’-TATA-box啟動子序列轉錄[37]。因此，miR-204的下調抑制抗氧化基因并激活促氧化基因，揭示了一種新的參與白內障發病機制的miR204-TATA box/3’-UTR基因調控網絡。秦宇等[39]研究發現miR-204在年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜中呈高表達，且miR-204通過靶向調控Bcl-2家族成員bcl-2、mcl-1使其表達降低，從而在年齡相關性白內障發病過程中發揮重要作用。

3.3 miR-204與青光眼miR-204是參與小梁網細胞調控通路的基因之一[40]，而小梁組織是房水的流出途徑，與青光眼的病理過程密切相關。G蛋白信號轉導調節蛋白5(RGS5)是HTM細胞中表達的非管家基因之一，Banaei-Esfahani等[41]發現miR-204可能靶向調控RGS5蛋白而參與青光眼的發病。在晚期青光眼高眼壓視網膜損傷大鼠模型中，miR-204下調了約4倍，還有其他7個miRNAs也顯著下調。這些基因富集于細胞外基質(ECM)，并且與EMT相關，這進一步驗證了miR-204對TGF-β信號通路的調節作用，即抑制miR-204表達可激活該通路的下游成分[42]。在視神經損傷模型大鼠的視網膜血管中，miR-204表達水平顯著升高，生長相關蛋白-43(GAP-43)表達降低；在大鼠眼部注射miR-204模擬物后，GAP-43表達降低，而miR-204抑制劑處理后GAP-43的表達顯著增加；注射miR-204模擬物的大鼠和模型組大鼠視網膜細胞凋亡率明顯升高，且miR-204抑制劑可有效逆轉模型組的凋亡率，說明miR-204通過抑制GAP-43促進視網膜細胞凋亡[43]。

3.4 miR-204與角膜損傷miRNA在角膜發育中起著關鍵的調節作用。An等[44]建立了一個影響創面愈合結局的miRNA基因網絡，并證實該網絡通過miR-204的差異表達來調控。在角膜傷口愈合過程中，miR-204的表達下調幅度最大。miR-204轉染的人角膜上皮細胞增殖明顯下降并誘導細胞周期G1停滯。Gao等[45]研究發現，miR-204-5p在糖尿病患者的角膜上皮中比非糖尿病患者的角膜上皮增加了近5倍，且SIRT1蛋白是miR-204-5p的直接靶點。在高糖條件下，通過調控Cyclin D1和p16可以下調miR-204-5p來增加小鼠角膜上皮細胞系(TKE2)生長，恢復細胞周期進程。下調miR-204-5p可使1型糖尿病模型Ins2(Akita)小鼠SIRT1表達上調，促進角膜上皮創傷愈合。miR-204-5p對SIRT1的調控可促進糖尿病性角膜病變上皮細胞周期循環。miRNA的下調還可促進人類角膜上皮細胞的增殖和遷移，說明其在角膜損傷愈合過程中具有重要作用。

3.5 miR-204與角膜新生血管角膜新生血管(CNV)會導致視力喪失。Kather等[46]研究顯示，在KLEIP基因敲除的小鼠角膜營養不良模型中，血管生成素1(Ang-1)表達增加，而miR-204表達減少，致使CNV形成。體外實驗證實miR-204的表達缺失調控Ang-1使其表達上調，因此，miR-204是一種新的Ang-1的調節因子。Zhang等[47]研究發現，上皮細胞來源的miR-204可通過調節血管內皮生長因子(VEGF)及其受體的表達來抑制縫線法誘導的小鼠角膜新生血管。miR-204主要在上皮細胞表達，而在有新生血管的角膜中表達下調。在小鼠結膜下注射miR-204激動劑可以抑制CNV，降低VEGF和VEGF受體2的表達。同樣，miR-204過表達減弱了VEGF在角膜緣上皮細胞(LECs)中的表達，抑制了人微血管內皮細胞(HMECs)的增殖、遷移和CNV形成。Lu等[48]發現在堿燒傷小鼠CNV模型中，重組腺相關病毒(rAAV)載體轉染miR-204后，可使CNV的多種靶基因和通路的表達趨于正常，從而減輕CNV。miR-204作為CNV的內源性抑制基因，是抑制CNV形成的潛在治療靶點。

3.6 TRPM3與視網膜疾病TRPM3通道存在于整個中樞神經系統，同時也是神經甾體類藥物硫酸孕烯醇酮(PregS)的受體。Webster等[49]發現，在發育中的視網膜神經節細胞(RGCs)中，PregS可導致TRPM3通道產生長時間的鈣瞬變，并增加RGCs自發性突觸電流的頻率；而在TRPM3基因敲除的小鼠視網膜中，未發現PregS介導的自發突觸電活動增加，證明TRPM3和內源性神經類固醇在視網膜發育過程中調節自發性突觸電活動。Brown等[50]提出，在視網膜中，TRP家族的兩種基因TRPM1和TRPM3呈高表達，而TRPM3在內叢狀層(IPL)、視網膜神經節細胞層(GCL)表達。應用TRPM3激動劑PregS可激活小鼠RGCs中TRPM3依賴性鈣信號通路。促炎細胞因子可能導致與ARMD有關的RPE細胞發生功能障礙，Kutty等[51]發現在ARPE-19細胞中，MITF、TRPM1和TRPM3基因以及miR-204和miR-211的表達減少會導致促炎細胞因子、趨化因子和細胞因子的表達增加，認為這些基因可以調節RPE細胞特異性基因的表達。Hughes等[52]研究表明TRPM1和TRPM3在缺乏視桿細胞和視錐細胞的小鼠眼中都受到光的調控，無論是TRPM1缺失還是TRPM3缺失的小鼠，瞳孔光反應都明顯減弱。TRPM3還在視網膜Müller細胞和睫狀體中表達，而在感光性視網膜神經節細胞中無表達，因此TRPM3在瞳孔光反應中起到間接作用。

3.7 TRPM3與視神經疾病鈣離子信號通路的激活是神經膠質細胞對多種細胞外刺激的普遍反應。Papanikolaou等[53]通過小鼠視神經切片和培養物的免疫標記證實，TRPM3通過鈣庫操縱性鈣內流(SOCE)來補充內質網鈣離子的存儲，并在小鼠星形膠質細胞和少突膠質細胞中表達，結果證明TRPM3是鈣通道的重要組成部分之一，支撐SOCE和ATP介導的鈣離子信號通道正常且持續發揮作用。

4小結

TRPM3/miR-204復合位點與年齡相關性白內障、青光眼、ARMD等眼部疾病的發病存在顯著聯系，其在眼的發育、眼部疾病的發生發展及治療中更是發揮著重要作用。在許多已知TRPM3蛋白表達的組織中，有些通道目前還沒有明確其功能作用，未來對TRPM3通道的研究有望在新層面揭示其新功能。隨著生物學技術的發展以及對眼部疾病病變機制的不斷研究，進一步了解不同眼部疾病特定的TRP通道/miRNA分子通路調控靶基因、調節相關因子表達、影響信號通路的作用機制，從基因水平為預防和治療眼科疾病開辟新前景十分重要。