火龍果莖多糖提取方法比較

李國勝 白新鵬

(海南大學食品科學與工程學院/熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心 海南海口 570228)

火龍果屬仙人掌科（Cactaceae）多年生攀緣植物，又名紅龍果、青龍果、仙蜜果等［1］。火龍果莖富含多種礦物質、植物甾醇、植物多糖、維生素E 以及黃酮類化合物等［2］，果莖中膳食纖維、黃酮類化合物含量豐富，是保健食品的重要加工原料。在多種化學成分中植物多糖的含量較高，達到7%左右［3］。火龍果莖具有生長迅速、分枝能力較強等特點，在火龍果種植過程中，為加快其生長并保持果實品質，一般僅保留一條主莖，需要不斷修剪分枝，產生了大量廢莖，可以作為火龍果莖多糖提取資源，變廢為寶［4］。

多糖的提取方法主要有內部沸騰法、酶提法、微波輔助法、超聲波輔助法、熱水浸提法及超高壓提取法等［5-8］。熱水提取法相比其它方法更簡便快捷、提取率高，為工業化提取火龍果莖多糖提供了新途徑［9］。馬若影等［10］研究表明，利用亞臨界水提取法來進行實驗，最佳提取條件為提取溫度140℃，提取時間25 min，料液比1∶50（g/mL）。超聲波輔助法的原理是對植物細胞壁造成破壞，主要是采用機械效應以及超聲波的空化對植物的細胞壁造成影響，這樣可以使細胞內活性物質的溶出效率大大提升，進而可以加快提取的速度［11］。目前我國對火龍果莖的研究報道比較少，火龍果莖加工產業幾乎還處于空白階段，因此火龍果莖的開發前景非常廣闊。該研究以火龍果莖為原材料，分別使用熱水提取法、亞臨界水提取法及超聲波輔助法來提取火龍果莖多糖，并對影響多糖提取率的各種因素進行相關分析；同時對不同方法制得的多糖樣品進行色澤、中性糖含量、紅外光譜等理化指標對比，綜合比較3種方法制取多糖的優劣，為火龍果莖的綜合開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

紅心火龍果莖由海南省東方市北緯十八度果業有限公司于2019年6月提供。

1.1.2 試劑

葡萄糖（A.R.）、濃硫酸（A.R.）、苯酚（A.R.）、鹽酸（A.R.）、廣州化學試劑廠，無水乙醇（A.R.）西隴科學股份有限公司。

1.1.3 儀器

FDU-2100 型冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司），FW-177 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），GL-20G-Ⅱ型離心機（上海安亭科學儀器廠），HT-250FC型亞臨界水提取裝置（上海霍桐實驗儀器有限公司），752-N 型可見紫外分光光度計（上海精密儀器科學有限公司），EV-321 旋轉蒸發儀（北京萊伯泰科儀器股份有限公司），KQ-800KDE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

1.2.1.1 熱水提取法

將火龍果莖粉碎，過40目篩，得到固體粉末，稱量2 g 加入提取瓶，混合一定比例蒸餾水并攪拌，熱水提取一定時間，離心取上清液濃縮，醇沉，離心分離，冷凍干燥得多糖粗品。

1.2.1.2 亞臨界水提取法

火龍果莖干燥后粉碎，濕潤吸水，加適量水并調節pH，在一定溫度和時間下進行提取，提取液離心分離，取上清液濃縮，醇沉靜置24 h，離心分離，冷凍干燥得粗多糖。

1.2.1.3 超聲輔助提取法

將紅心火龍果莖粉碎、過40目篩、得到粉末，稱量2 g，加入蒸餾水，均勻攪拌，進行超聲輔助提取，超聲處理考慮條件為：超聲時間、處理功率、提取溫度、料液比。離心，濃縮，混合乙醇（95%），低溫240 min 進行醇沉。離心分離，洗滌，冷凍干燥，得多糖粗品。

1.2.2 火龍果莖多糖的測定

準備火龍果莖多糖5 mg，加水定容到50 mL，該溶液的濃度為0.1 mg/mL，然后對其進行吸光度的測定，利用葡萄糖溶液獲得標準曲線，再代入吸光度計算得到火龍果莖多糖的含量。

火龍果莖多糖提取率＝［（C×V）/W］×100%

式中，C為樣品溶液中多糖濃度（mg/mL），V為樣品溶液體積（mL），W為火龍果莖粉質量（mg）。

1.2.3 色澤判定

肉眼觀察，對色澤進行描述并記錄。

1.2.4 中性糖含量測定

用硫酸-苯酚法［11］得到多糖的標準曲線為Y＝48.557 1X＋0.006 1，R2＝0.993 7。移取 2 mg/mL多糖供試液10 mL，加入5 mL 5%十六烷基三甲基溴化銨溶液，攪拌均勻后，40℃靜置5 h，離心，取上清液定容到50 mL，得到中性多糖供試液。準確量取0.1 mL 中性多糖供試液，混合1.0 mL 5.0%苯酚溶液，緩慢加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，沸水浴15 min左右，靜置至室溫，在490 nm最大吸收峰處測定其吸光度，得出含量。

1.2.5 紅外光譜分析

取用不同方法制得的干燥火龍果莖多糖樣品約2 mg與溴化鉀粉末約200 mg，于瑪瑙研缽中，在干燥的情況下混勻，研磨均勻后置于壓片機內壓制成片，采用傅里葉光譜儀TENSOR27 對多糖組分進行分析。使樣品在4 000～400 cm-1波長內進行掃描，得到紅外光譜圖。

1.2.6 數據分析

采用Excel 2010 軟件進行數據整理和作圖，所有試驗重復3 次，取平均值。并使用Omnic 8.2軟件進行數據分析與整理。

2 結果與分析

2.1 熱水提取法

2.1.1 提取溫度

將液料比設置為25∶1（mL/g），加熱的時間為3 h，分別放置于75、80、85、90℃下進行提取。提取率如圖1 所示。由圖1 可知，隨著溫度的提高，多糖提取率先大幅增加，而后緩慢下降。由此可知，當提取溫度80℃時，多糖的提取率達到最大值2.78%。

圖1 提取溫度與提取率的關系

2.1.2 提取時間

液料比設定為 25∶1 （mL/g），提取溫度為80℃，然后設定提取時間分別為0.5、1、2 和3 h，由此觀察提取時間對提取率的影響，從而確定最佳的提取時間，結果詳見圖2。由圖2 可知，當溫度不變時，隨著提取時間的延長，提取率逐漸提高，1～2 h 提取率增加的速度最快，由1.4%提高到2.99%，而2～3 h 提取率緩慢上升，在3 h 時達到最大值3.11%，綜合考慮時間成本，選擇最佳提取時間為3 h。

圖2 提取時間與提取率的關系

2.1.3 液料比

提取時間3 h，溫度80℃的條件下，分別以15∶1、20∶1、25∶1 及30∶1（mL/g）進行液料的比例設置。從圖3可以看出，隨著液料比的增加，在15∶1～25∶1（mL/g），曲線呈現上升趨勢，說明火龍果莖多糖的提取率在此范圍內逐漸增加，而后提取率下降。因此最佳液料比例為25∶1（mL/g），此時提取率最高，達4.12%。

圖3 液料比與提取率的關系

根據上述單因素試驗，使用熱水提取法時，提取最佳條件為3 h、80℃、液料比例25∶1（mL/g），提取率達到最高為4.12%。

2.2 亞臨界水提取法

2.2.1 提取時間

固定料液比為1∶40（g/mL）、140℃、pH 5，分析不同提取時間對提取率的影響，得到最優提取時間，結果如圖4。由圖4 可看出，最適的提取時間是25 min，此時提取率達到20.53%。而提取時間更久反而得率下降，原因可能是隨著提取時間的增加，導致細胞破碎度逐漸增大，過多碎片阻礙多糖溶出，導致提取率下降［12］。

圖4 提取時間與提取率的關系

2.2.2 提取溫度

當條件為1∶40（g/mL）、pH 5、25 min，提取溫度分別160、140、120、110℃，分析在不同溫度對提取率的影響，結果如圖5。由圖5 可知，在110～140℃，多糖提取率隨提取溫度升高而明顯增加，當溫度為140℃時，多糖提取率達到最大20.53%。但當溫度達到160℃時，多糖提取率下降，這說明適當的升高溫度可提高多糖提取率，但是過高的溫度可通過褐變反應致使多糖降解［13］。所以，最佳提取溫度為140℃。

圖5 提取溫度與提取率的關系

2.2.3 液料比

固定條件為140℃、pH 5、25 min，液料比例為50∶1、40∶1、30∶1、20∶1（mL/g） 時，對多糖提取率的影響，結果如圖6 所示。從圖6 可知，多糖提取率隨著液料比的增加先提高后降低，在液料比為40∶1（mL/g）時，提取率達到了20.53%的峰值，這可能是因為液料比的增加可以加速去離子水向細胞中擴散并增強其對多糖的吸附性［14］。隨著液料比的繼續增加，多糖提取率下降，過量的去離子水會使多糖溶解達到飽和狀態，導致提取率降低［15］。所以，選擇液料比40∶1（mL/g） 為最佳條件。

圖6 液料比與提取率的關系

2.2.4 pH

當液料比為1∶40（g/mL），提取溫度140℃，提取時間25 min，探究不同pH 對提取率的影響，結果見圖7。從圖7 可以看出，pH 5 時，提取率達到最大值。當pH 持續增加時，提取率有所下降。因此選擇pH 5為最適條件。

圖7 pH值與提取率的關系

采用亞臨界水提取法，以提取時間、提取溫度、液料比以及pH 值作為影響因素，最優工藝為提取時間25 min、提取溫度140℃、液料比例40∶1（mL/g）、pH 5時，提取率達到最佳20.53%。

2.3 超聲輔助提取法

2.3.1 超聲時間

將條件固定為60℃、1∶20（g/mL）、240 W，超聲時間分別為4、9、14、19 min，分析不同超聲時間對提取率的影響，結果見圖8。從圖8 可知，當提取時間為9 min時，提取率最高為2.18%。

圖8 提取時間與提取率的關系

2.3.2 液料比

將條件固定為60℃，240 W、9 min，探究不同液料比對提取率造成的影響，結果見圖9。從圖9可以看出，多糖提取率隨著液料比的增加呈先升后降的趨勢，液料比為20∶1（mL/g）時，提取率達到最大值。因此，選用的液料比為20∶1（mL/g）。

圖9 液料比與提取率的關系

2.3.3 提取功率

將超聲溫度固定在60℃，料液比1∶20（g/mL），超聲時間9 min，分析不同超聲功率下，提取率的變化，結果見圖10。由圖10 可知，當超聲功率為240 W時，火龍果莖多糖的提取率達最高為2.18%。當超聲時間一定時，超聲功率越大，機械剪切和空化作用越強，多糖提取量逐漸增加，但當功率過大易導致糖苷鍵的斷裂，從而使多糖提取率降低［16］。因此，選用最佳超聲功率為240 W。

圖10 超聲功率與提取率的關系

2.3.4 提取溫度

將液料比固定為20∶1（mL/g），超聲功率240 W，超聲時間9 min，對不同超聲溫度下的提取率進行比較分析，結果見圖11。由圖11 可知，當提取溫度為60℃，提取率最高為2.18%。

圖11 提取溫度與提取率的關系

采用超聲輔助提取法，分析了4個影響因素對提取率的影響，最佳工藝為提取溫度60℃、超聲功率為240 W、液料比20∶1（mL/g）、超聲時間9 min時，提取率為2.18%。

2.4 綜合比較

在用不同提取方法所得多糖粗品后，對這些多糖粗品進行初步的基礎性質評定，包括顏色是否潔凈，形態是否穩定，探究采用不同的提取方法對提取物造成的影響，結果詳見表1。根據表1可知，3 種方法獲得的提取物顏色相差不大；亞臨界水提取法的提取率最高為20.53%，中性糖的含量最高達到89.45%，超聲輔助提取法的提取率及中性糖含量最低，僅有38.50%；熱水提取法的提取率及中性糖含量介于二者中間。推測原因為熱水提取時間過長，導致多糖部分溶于水中，效果較差；而超聲輔助提取受超聲波影響，部分多糖組分溶出未能被提取，且時間較短導致提取率較低。但亞臨界提取法存在設備要求高，耗能高等不足，難以實現規模化提取。

表1 不同提取方法所得多糖樣品的綜合比較

2.5 紅外圖譜分析

不同提取方法所得的多糖紅外光譜如圖12 所示。在3 412 cm-1處的強吸收峰是由-OH官能團的伸縮振動引起，峰形較寬，表明多糖存在分子內或分子間有氫鍵；烷基C-H在2 930 cm-1附近產生的伸縮振動吸收峰是糖類物質的典型特征吸收峰；在1 610 cm-1附近的強吸收峰是由C＝O 的不對稱伸縮振動引起的；在1 419～1 200 cm-1是C-H 的變形振動引起的吸收峰。1 078 cm-1處的一組強吸收峰是由糖環上C-O-C 的伸縮振動引起的，且該峰為吡喃環的特征吸收峰［17］，說明火龍果莖多糖具有吡喃環結構；891 cm-1處的吸收峰表明火龍果莖多糖具有β-型糖苷鍵。3種粗多糖紅外光譜圖均含有典型的多糖特征吸收峰，且具有相似的紅外光譜，由此可以認定，3種粗多糖在化學結構上基本一致。

圖12 火龍果莖多糖紅外光譜圖

3 討論與結論

火龍果莖的開發利用前景十分廣闊，除刺后，可切成片鮮食，用果汁機打碎可作冷飲或調制冰淇淋［1］。植物多糖具有多方面的生物活性，常作為保健食品的營養成分，火龍果莖含有豐富的營養成分，具有特殊的生理功能，尤其是植物性多糖的含量較高。因此，火龍果莖多糖開發利用前景廣闊［2］。熱水提取、亞臨界水提取及超聲輔助提取3種方法所得火龍果莖粗多糖的提取率分別為4.12%、20.53%和2.18%，使用亞臨界水提取法的提取率最高。但亞臨界水提取法對設備的要求較高，難以實現大規模提取；使用熱水提取法的提取率雖較低，但本方法對設備的要求不高，易于實現，只是存在提取時間較長，消耗能源較大等缺點；超聲輔助提取法的提取率相對較低，但這種方法耗時較短。所以，多糖的提取分離應根據不同種類多糖的性質選擇合適的方法，盡量避免單一方法，同時聯合應用兩種或多種提取分離方法。3 種方法得到的粗多糖顏色相近；且經紅外光譜分析3 種粗多糖具有相似的紅外光譜，均含有典型的多糖特征吸收峰，火龍果莖多糖具有吡喃環結構并呈現β-型糖苷鍵吸收峰；不同方法提取的粗多糖樣品結構無明顯差異。該研究為有效利用火龍果莖提供了理論依據。