基于TLR2/4-NF-κB信號通路研究刺五加多糖對雞淋巴細胞的調節作用

張英楠 ， 張桂山 ， 徐 晶 , 楊樹寶,4

(1. 長春科技學院生命科學學院 ， 吉林 長春 130600 ； 2. 吉林醫藥學院公共衛生學院 ， 吉林 吉林 132013 ； 3. 吉林醫藥學院基礎醫學院 ， 吉林 吉林 132013 ； 4. 吉林農業大學動物科技學院 ， 吉林 長春 130118)

近年來，關于各種多糖對動物免疫調節的研究很多，但大多數只是對一些免疫指標(如抗體效價、免疫器官指數、淋巴細胞增殖功能等)進行檢測，而對多糖具體通過什么途徑來影響免疫細胞及免疫分子的增殖、分化和分泌等，即多糖調控免疫活性的機制具體是什么還了解較少。但是最近幾年，隨著細胞和分子手段的不斷應用，許多學者也對多糖的免疫調節機理進行了探索，并得到了一些突破性的成果。目前，研究最為透徹的即為Toll樣受體/核因子-κB(TLRs/NF-κB)信號通路，它的發現對于揭示多糖免疫機制具有重要意義[1-2]。研究發現在細胞表面存在多種多糖作用受體，如 TLR2、TLR4等，多糖可以通過與這些受體結合，激活細胞內信號通路，活化NF-κB，促進免疫細胞增殖，誘導細胞因子的釋放，進而發揮免疫調節作用，因此目前被認為最經典的多糖免疫調節通路為TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，一些學者也嘗試利用TLR2、TLR4抗體以及NF-κB阻斷劑PDTC等阻斷此條信號通路的刺激信號傳輸[3-4]，從而研究多糖的免疫調節機制。

本課題組前期研究表明，刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)具有促進免疫器官及黏膜淋巴組織發育、淋巴細胞定位分布、血液中CD4+T淋巴細胞數量、淋巴細胞增殖功能、抗體效價、細胞因子分泌等免疫調節作用，Th1類細胞因子IFN-γ和IL-2促進血液中CD4+T淋巴細胞含量、Th2類細胞因子IL-4和IL-10抑制Th1類細胞活性并增加抗體產生等[5-6]，但是關于具體的作用機制還有待于進一步發掘和探究。因此，本試驗結合經典的信號通路TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB，以雞血液淋巴細胞為研究對象，觀察用 TLR2 和TLR4抗體和 NF-κB阻斷劑PDTC處理雞外周血淋巴細胞后，各種細胞因子mRNA 表達量的變化，探究可能的信號通路，從而初步揭示ASPS的免疫調節機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 10只30日齡健康海蘭褐蛋雞，購自長春市農業科學研究院種雞場。

1.2 主要試劑 刺五加多糖由本實驗室提取和純化，多糖純度為 81%。肝素鈉、RPMI-1640培養液，均購自鼎國生物技術公司；胎牛血清，購自美國Gibco；疊氮鈉，購自北京化工；淋巴細胞分離液，購自灝洋生物制品公司；紅細胞裂解液，購自碧云天生物技術研究所；總RNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix，均購自北京天根生化科技有限公司；反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (DRR047A)、實時熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，均購自寶生物工程(大連)有限公司；TLR2和TLR4抗體，均購自北京博奧森生物技術有限公司；PDTC，購自Sigma公司。

1.3 主要儀器 冷凍離心機5424R，Eppendorf公司；水平離心機,Fastwin公司；12孔細胞培養板，德國Greiner Bio-One公司；ABI StepOneTM實時熒光定量PCR儀。

1.4 方法 將分離得到的淋巴細胞懸液加入12孔細胞培養板中，每孔加入500 μL，在不同孔中分別加入終濃度為20 μg/mL的TLR2和TLR4抗體以及10 μmol/L的PDTC，培養1 h，然后加入200 μL終濃度200 μg/mL ASPS進行培養。另設不加任何處理的空白對照組和只加200 μg/mL ASPS的ASPS處理組。39.5 ℃、5%CO2培養箱培養24 h后，取細胞上清液，收集淋巴細胞，進行總RNA提取和反轉錄，并對IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α等細胞因子的mRNA表達水平進行熒光定量PCR檢測。引物序列見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 用于實時熒光定量PCR擴增的雞細胞因子引物Table 1 Primers used for the real-time fluorescence quantitative PCR amplification of chicken cytokines

1.5 數據分析 將得到各樣品的平均Ct值采用ΔΔCt法進行計算分析，公式為2-ΔΔCt。各組均以12 h 空白組為樣本對照，計算其他各試驗組相對于12 h空白組的表達量倍數，試驗數據以Means±SD 表示，SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan’s 法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 ASPS對TLR2和TLR4抗體阻斷的淋巴細胞的細胞因子mRNA表達水平的影響 結果如圖1A所示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-2 mRNA相對表達量顯著增加，約是空白對照組的6倍左右。應用TLR2抗體和ASPS共處理(TLR2+ASPS組)后，IL-2 mRNA表達量并未明顯下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理(TLR4+ASPS組)后，IL-2 mRNA表達量明顯下降，但下降幅度較小，仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細胞IL-2 mRNA的表達，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細胞IL-2 mRNA的表達。

圖1B顯示，與IL-2相似，ASPS處理組淋巴細胞中IFN-γmRNA相對表達量顯著增加。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，IFN-γmRNA表達量并未下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IFN-γmRNA表達量明顯下降，仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細胞IFN-γmRNA的表達，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細胞IFN-γmRNA的表達。

圖1C顯示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-4 mRNA 相對表達量并未顯著增加，與空白對照組比較差異不顯著(P>0.05)。分別應用TLR2 和TLR4抗體與ASPS共處理后，IL-4 mRNA表達量并無明顯變化(P>0.05)。說明TLR2和TLR4抗體對阻斷淋巴細胞IL-4 mRNA的表達無影響。

圖1D顯示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-10 mRNA相對表達量顯著增加。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-10 mRNA表達量并未下降，與ASPS處理組相近。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-10 mRNA表達量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細胞IL-10 mRNA的表達，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細胞IL-10 mRNA的表達。

圖1E顯示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-1βmRNA相對表達量顯著增加。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-1βmRNA表達量顯著下降，與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-1βmRNA表達量并未下降，與ASPS處理組相近。表明TLR2抗體能夠完全阻斷淋巴細胞IL-1βmRNA的表達，而TLR4抗體則不能阻斷淋巴細胞IL-1βmRNA的表達。

圖1F顯示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-6 mRNA相對表達量顯著增加。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，IL-6 mRNA表達量略有下降，與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，IL-6 mRNA表達量顯著下降，但同時仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。表明TLR2抗體不能阻斷淋巴細胞IL-6 mRNA的表達，而TLR4抗體可以部分阻斷淋巴細胞IL-6 mRNA的表達。

圖1G顯示，ASPS處理組淋巴細胞中iNOSmRNA相對表達量顯著增加，而且增加幅度較大，為空白對照的6倍左右。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，iNOSmRNA表達量顯著下降，介于ASPS處理組和空白對照組之間。而TLR4抗體和ASPS共處理后，iNOSmRNA表達量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體可以部分阻斷淋巴細胞iNOSmRNA的表達，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細胞IL-10 mRNA的表達。

圖1H顯示，ASPS處理組淋巴細胞中TNF-αmRNA相對表達量顯著增加。應用TLR2抗體和ASPS共處理后，TNF-αmRNA表達量顯著下降，但仍顯著高于空白對照組(P<0.05)。而TLR4抗體和ASPS共處理后，TNF-αmRNA表達量顯著下降，并且與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。表明TLR2抗體可以部分阻斷淋巴細胞TNF-αmRNA的表達，而TLR4抗體可以完全阻斷淋巴細胞TNF-αmRNA的表達。

圖1 ASPS對TLR2和TLR4抗體阻斷的淋巴細胞細胞因子mRNA相對表達量的影響Fig.1 Effects of ASPS on cytokines mRNA relative expression level of lymphocytes that TLR2 and TLR4 antibodies blocked肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)，肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05); 下同Different letters on the shoulder mark indicated significant difference (P<0.05),while the same letters on the shoulder mark indicated no significant difference (P>0.05). The same as below

2.2 ASPS對PDTC阻斷的外周血淋巴細胞的細胞因子mRNA表達水平的影響 結果如圖2所示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-2、IFN-γ和IL-10 mRNA相對表達量顯著增加，均顯著高于空白對照組(P<0.05)，而IL-4無明顯變化。應用PDTC和ASPS共處理后，IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA表達量無明顯下降，與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)，但是IL-10 mRNA表達量卻顯著下降，接近空白對照組。表明PDTC對阻斷淋巴細胞IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA 的表達沒有作用，但可以顯著阻斷IL-10 mRNA 的表達。

圖2 ASPS對PDTC阻斷的血淋巴細胞IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 mRNA表達水平的影響Fig.2 Effects of ASPS on IL-2，IFN-γ,IL-4 and IL-10 mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

如圖3所示，ASPS處理組淋巴細胞中IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-αmRNA相對表達量顯著增加，均顯著高于空白對照組(P<0.05)。應用PDTC和ASPS共處理后，IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表達量顯著下降，并接近空白對照組，IL-6也有所下降，但是與ASPS處理組差異不顯著(P>0.05)。表明PDTC對阻斷淋巴細胞IL-1β、iNOS和TNF-αmRNA表達的作用十分顯著，但并不能完全阻斷，另外對IL-6 mRNA表達的阻斷作用較小。

圖3 ASPS對PDTC阻斷的血淋巴細胞IL-1β、IL-6、iNOS和TNF-α mRNA表達水平的影響Fig.3 Effects of ASPS on IL-1β,IL-6，iNOS and TNF-α mRNA relative expression level of lymphocytes that PDTC blocked

3 討論

多糖通過復雜的信號轉導途徑刺激淋巴細胞免疫應答，其信號通路的研究存在一定的經驗性和復制性。目前,推導多糖刺激淋巴細胞免疫信號通路的方法主要是通過已知受體的抗體或已知激酶的抑制劑來阻斷細胞信號轉導,從而推測該受體或激酶是否參與多糖的免疫調控過程。TLR2/4→TRAF6→IKKc→NF-κB是目前已知的最為經典的多糖免疫調節信號通路，很多學者對不同多糖針對這一通路進行了驗證[7-12]，并證實其普遍的適用性。因此本試驗應用TLR2抗體、TLR4抗體和NF-κB阻斷劑PDTC分別與ASPS共處理淋巴細胞，觀察對細胞因子mRNA表達的阻斷效果，從而確定各種細胞因子的產生與此通路的關系。

本試驗發現，TLR2抗體能夠完全阻斷IL-1βmRNA的表達，并且PDTC也能顯著阻斷IL-1βmRNA的表達，由于IL-1β主要由單核巨噬細胞產生，而且TLR2是巨噬細胞上的重要Toll樣受體，另外由于PDTC也能顯著阻斷IL-1βmRNA的表達，因此ASPS對巨噬細胞刺激產生IL-1β的機制可能為：ASPS可以與巨噬細胞上的TLR2受體結合，經TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB通路活化NF-κB，調控IL-1β在細胞內的轉錄和表達。這與Lee等[13]關于柿子多糖免疫調節信號通路、Li等[14]關于光滑環銹傘多糖對骨髓源樹突狀細胞的免疫調節通路、Sun等[15]對獼猴桃多糖對巨噬細胞免疫調節的信號通路等的研究結果相一致。

本試驗同時發現，TLR4抗體可以完全阻斷IL-10、iNOS和TNF-αmRNA的表達，而且PDTC對阻斷淋巴細胞IL-10、iNOS和TNF-αmRNA表達的作用也十分顯著，由于IL-10主要由Th2細胞和單核巨噬細胞產生，而TLR4只能表達在B細胞或巨噬細胞等髓樣細胞上，而Th2細胞并不表達，因此可以推斷體外培養24 h的淋巴細胞在ASPS作用下所表達的IL-10 mRNA應該都是巨噬細胞產生，而Th2細胞要產生IL-10時間應該再滯后。本試驗還發現，TLR2抗體也能夠部分阻斷iNOS和TNF-αmRNA 的表達，iNOS和TNF-α是巨噬細胞分泌的重要細胞因子，因此可以證明ASPS可以與巨噬細胞上的TLR2和TLR4受體結合，但更傾向與TLR4受體結合，從而促進其表達IL-10、iNOS和TNF-αmRNA，其可能的信號通路為主要為TLR4→TRAF6→IKKc→ NF-κB，TLR2→TRAF6→IKKc→NF-κB也有一定作用，另外這與韓杰等[16]關于刺五加多糖對斷奶仔豬外周血淋巴細胞信號傳導影響的研究結果一致。

TLR4抗體可以部分阻斷ASPS促進IL-2和IFN-γmRNA的表達，而TLR2抗體和PDTC對IL-2和IFN-γmRNA的表達均沒有影響。由于IL-2和IFN-γ主要由Th1類細胞產生，而且Th1類細胞可以在巨噬細胞產生的細胞因子如IL-1β等的刺激下增殖分化，產生更多的IL-2和IFN-γ，而且TLR4主要存在于巨噬細胞或B細胞，因此IL-2和IFN-γmRNA的表達應該與TLR4→TRAF6→IKKc→NF-κB 信號通路無關，對于TLR4抗體可以部分阻斷ASPS促進IL-2和IFN-γmRNA的表達，可能原因是：TLR4抗體使IL-1β等巨噬細胞分泌因子減少，因而Th1類細胞缺少了一部分刺激，從而導致IL-2和IFN-γmRNA下降。但是對于ASPS促進IL-2和IFN-γmRNA的表達具體與什么通路直接相關還有待于以后繼續研究。

細胞內信號轉導通路錯綜復雜，多糖在進行免疫調節時涉及多條通路，而且各通路之間可能存在相互作用，另外多糖的結構復雜，多糖分子的結合受體較多，要完全闡明多糖的免疫調節機制依然是任重而道遠，本試驗結合ASPS對雞的各種免疫調節作用，通過對TLR2/4→TRAF6→ IKKc→NF-κB通路的追蹤，初步對免疫機制進行探索性的研究，以后還要對ASPS對免疫調節機制更進一步研究。