口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病疫苗聯(lián)合免疫臨床效果評(píng)估

劉國(guó)民 ， 高日明 ， 林文耀 ， 宋慶慶 ， 尚 策 ， 王 凱

(金宇保靈生物藥品有限公司 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

在非洲豬瘟背景下部分養(yǎng)豬場(chǎng)采取靜默生產(chǎn)、少打疫苗、不打疫苗或減少豬只接觸等方式防控非洲豬瘟，通過(guò)臨床實(shí)踐證明，規(guī)模化豬場(chǎng)主要通過(guò)生物安全、物理隔斷或改變常規(guī)免疫程序等方式來(lái)防控非洲豬瘟，但不打常規(guī)疫苗是一種不科學(xué)的做法，常規(guī)疾病防控也是生物安全的工作內(nèi)容之一。為有效減少接觸，降低疫苗免疫次數(shù)，孟麗軍等做了大量活疫苗與滅活疫苗聯(lián)合免疫方案的研究，疫苗操作時(shí)大部分用的是疫苗分點(diǎn)注射[2]。而本試驗(yàn)探討口蹄疫(Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)、豬瘟(Classical swine fever，CSF)、偽狂犬病(Pseudorabies,PR)3種常規(guī)疫苗聯(lián)合使用的可行性，目的是提高基層免疫工作質(zhì)量，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減少工作量，提高口蹄疫、豬瘟、偽狂犬病免疫密度和免疫效果，降低豬群疫病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從而為制定聯(lián)合免疫程序提供參考[1]。

1 材料與方法

1.1 疫苗 口蹄疫滅活疫苗由金宇保靈生物藥品有限公司提供(商品名：金OA)，批號(hào)：18392243；豬瘟ST傳代細(xì)胞苗由遼寧益康提供(商品名：瘟康)，批號(hào)：201841；偽狂犬病耐熱保護(hù)劑C株苗由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司提供(商品名：偽狂寧)，批號(hào)：18251003，上述疫苗均按說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行保存、運(yùn)輸。

1.2 試劑 口蹄疫O/A型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號(hào)：2019122401；豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，IDEXX公司產(chǎn)品，批號(hào)：433220-P361；豬偽狂犬病gB抗體ELISA試劑盒(ADV-gB)，由荷蘭BioChek百測(cè)公司提供，批號(hào)：2331106；其他常規(guī)儀器均由國(guó)家獸用工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 選取廣西玉林某規(guī)模豬場(chǎng)的后備母豬1 000頭、 陸川某規(guī)模豬場(chǎng)的經(jīng)產(chǎn)母豬1 000頭、 桂林區(qū)域的保育豬2 500頭進(jìn)行此次試驗(yàn)，采取人工投料，豬只自由采食，自由飲水，試驗(yàn)周期為2019年6月1日—2020年2月1日。

1.4 試驗(yàn)方案

1.4.1 疫苗理化性檢驗(yàn)和疫苗活性的評(píng)估 在實(shí)驗(yàn)室條件下用口蹄疫滅活疫苗稀釋豬瘟、偽狂犬疫苗，檢測(cè)稀釋后疫苗的理化性、活性是否受影響。主要檢測(cè)口蹄疫滅活疫苗的pH、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)、黏度、粒度和穩(wěn)定性，并通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)混合后的豬瘟疫苗、偽狂犬疫苗的活性，分析組合免疫方案的可行性。具體操作：取2瓶豬瘟凍干苗，其中1瓶用20 mL口蹄疫滅活苗復(fù)溶，復(fù)溶后于室溫作用0、1 h和2 h，分別用MEM溶液作10倍系列稀釋進(jìn)行TCID50檢測(cè)；另1瓶豬瘟疫苗做常規(guī)疫苗稀釋；取3瓶偽狂犬病凍干苗，用10 mL口蹄疫滅活苗進(jìn)行復(fù)溶，復(fù)溶后于室溫作用0、1 h和2 h后，分別用MEM溶液進(jìn)行10倍系列稀釋進(jìn)行TCID50檢測(cè)。

1.4.2 疫苗在豬場(chǎng)安全性和有效性的評(píng)估 為驗(yàn)證組合免疫在豬場(chǎng)的安全性和有效性，將后備豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、保育豬分別分成5個(gè)組，即A、B、C、D組和E組，均于40日齡時(shí)免疫對(duì)應(yīng)的疫苗，70日齡時(shí)進(jìn)行二免，通過(guò)測(cè)定口蹄疫、豬瘟、偽狂犬抗體水平，分析各組別之間的差異，最終確定組合免疫在臨床上的可行性。A、B、C組為單因素對(duì)照組，其中A組豬只僅免疫豬瘟疫苗(CSF)，用豬瘟稀釋液稀釋；B組豬只僅免疫偽狂犬疫苗(PR)，用偽狂犬稀釋液稀釋；C組豬只僅免疫口蹄疫滅活疫苗(FMD)；D組和E組為聯(lián)合免疫組，其中D組豬只免疫豬瘟和偽狂犬疫苗組合疫苗(CSF+PR)，用偽狂犬或豬瘟稀釋液稀釋；E組豬只免疫口蹄疫、豬瘟、偽狂犬聯(lián)合混合疫苗(FMD+CSF+PR)，用口蹄疫稀釋液稀釋。上述組別均需要在免疫前采血評(píng)估豬群抗體水平及健康程度；分別在一免后30 d、二免后30 d采血評(píng)估免疫效果，免疫注射時(shí)給所有豬只佩戴耳標(biāo)、做好記錄。試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫方案見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與免疫方案Table 1 Grouping and immunization plan of test animals

1.4.3 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室評(píng)估物理性質(zhì)與疫苗活性 結(jié)果見(jiàn)表2、表3。用口蹄疫滅活苗復(fù)溶豬瘟、偽狂犬病凍干苗時(shí)，豬瘟凍干苗溶解較慢，在2～3 min后能夠全部溶解，而偽狂犬病疫苗在1～2 min全部溶解；疫苗溶解后pH介于7.23～7.60；混合后的疫苗黏度介于25.29～43.45CP；混合后的疫苗通過(guò)粒度檢測(cè)都是標(biāo)準(zhǔn)單峰，離心沒(méi)有水乳分層，豬瘟、偽狂犬病疫苗通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒含量無(wú)顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明使用口蹄疫滅活疫苗可以有效稀釋豬瘟、偽狂犬病疫苗，而且豬瘟、偽狂犬病疫苗活性不受影響。

表2 試驗(yàn)組與對(duì)照組疫苗理化性檢驗(yàn)分析Table 2 Analysis of physical and chemical tests of vaccines between the test group and the control group (n=4)

表3 試驗(yàn)組與對(duì)照組疫苗豬瘟、偽狂犬活性分析Table 3 Analysis of the viability of vaccines against swine fever and pseudorabies in the test group and the control group (n=4)

2.2 臨床評(píng)估聯(lián)合免疫效果

2.2.1 免疫應(yīng)激反應(yīng)觀察 聯(lián)合免疫推廣區(qū)域豬只免疫后24 h內(nèi)個(gè)別區(qū)域有零星輕微應(yīng)激，通過(guò)物理?yè)尵群团R床處理均未出現(xiàn)死亡，推廣區(qū)域的大部分豬只均未出現(xiàn)精神沉郁、飲食減退和死亡等異常免疫反應(yīng)情況，見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)豬免疫副反應(yīng)情況Table 4 Immune side effects of test pigs n=39

2.2.2 口蹄疫抗體指標(biāo)效果分析 結(jié)果見(jiàn)表5和圖1，通過(guò)口蹄疫抗體水平試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，豬群?jiǎn)为?dú)免疫口蹄疫疫苗2次，抗體水平與疫苗混合組(口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病)抗體水平差異不明顯(P>0.05)，說(shuō)明單獨(dú)免疫效果與組合免疫效果相當(dāng)，即組合免疫組(口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病)注入豬體后不影響口蹄疫免疫效果；通過(guò)一免后30 d和二免后30 d抗體數(shù)據(jù)分析可知，組合免疫組與單獨(dú)免疫口蹄疫組的免疫持續(xù)期差異不顯著(P>0.05)，特別是組合免疫組二免后30 d效果幾乎不受影響。

圖1 口蹄疫抗體指標(biāo)比較Fig.1 Comparison of antibody indexes in foot-and-mouth disease

2.2.3 豬瘟抗體指標(biāo)效果分析 結(jié)果見(jiàn)表5和圖2，通過(guò)豬瘟抗體分析可知，免疫前抗體水平與一免后30 d、二免后30 d差異不顯著，組間比較，各組之間差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明組合免疫組不影響豬瘟免疫效果。

圖2 豬瘟抗體指體比較Fig.2 Comparison of antibody indexes in swine fever

2.2.4 偽狂犬病抗體指標(biāo)效果分析 結(jié)果見(jiàn)表5和圖3，通過(guò)偽狂犬病抗體分析可知，組合免疫組一免后30 d、二免后30 d與免疫前的gB抗體水平差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明免疫疫苗后偽狂犬病抗體快速提升，保護(hù)力提高。但從組間分析可知，聯(lián)合免疫組抗體水平高于單苗免疫組，組合免疫組不影響偽狂犬疫苗的免疫效果。

圖3 偽狂犬gB抗體指標(biāo)比較Fig.3 Comparison of gB antibody indexes in pseudorabies

表5 口蹄疫、豬瘟、偽狂犬疫苗組合免疫抗體持續(xù)期跟蹤分析Table 5 Tracking analysis of the duration of immune antibody in FMD,SFV,and PR combinational vaccine (n=15)

3 討論

國(guó)內(nèi)科研人員在豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征疫苗同步免疫研究方面進(jìn)行了較多的試驗(yàn)探索[3-4],并取得了一些成功經(jīng)驗(yàn)。有研究指出，豬口蹄疫疫苗與豬瘟脾淋活疫苗可同時(shí)進(jìn)行免疫,而豬口蹄疫不能與高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗進(jìn)行同時(shí)免疫,3種疫苗不能同時(shí)免疫,存在相互干擾現(xiàn)象[5]。陸國(guó)林等[6]提出，豬瘟、豬口蹄疫和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗可同時(shí)分點(diǎn)免疫。相關(guān)研究還有很多，結(jié)論有所不同，原因有待科研人員進(jìn)一步研究。

3.1 非瘟?xí)r代下，降低人豬接觸的重要性 在非洲豬瘟肆虐的背景下，做好口蹄疫、偽狂犬病和豬瘟的免疫防控可以有效提高豬群的健康，提高易感動(dòng)物的抵抗力，筑起抵抗非洲豬瘟的防線。有研究表明，相同感染劑量下，液體組和飼料組隨著暴露次數(shù)增加，非洲豬瘟的感染概率也隨之增加。當(dāng)液體組的暴露次數(shù)達(dá)到10次時(shí)，最低感染劑量1 TCID50的感染概率接近1。由此可見(jiàn)，減少免疫次數(shù)的同時(shí)減少人豬接觸的次數(shù)，降低針頭傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可大大降低非洲豬瘟感染的概率，多聯(lián)多價(jià)、組合免疫是未來(lái)豬場(chǎng)免疫程序變化的必然趨勢(shì)。

3.2 降低人豬接觸、減少應(yīng)激，構(gòu)建“一針多防”的組合免疫方案的可行性 豬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)究其原因可分為內(nèi)部原因和外部原因，內(nèi)部原因主要是由于豬自身的身體狀況、品種以及個(gè)體之間的差異性所導(dǎo)致的；而外部原因主要與疫苗的儲(chǔ)存、純化工藝有關(guān)；應(yīng)用高純度、高純化的疫苗，可以減少因疫苗因素造成的豬只應(yīng)激，減少疫苗中的雜蛋白、細(xì)胞碎片、內(nèi)毒素，可降低豬只應(yīng)激率；豬只免疫前添加一些抗應(yīng)激藥如中草藥、維生素、礦物質(zhì)、電解質(zhì)，可以增強(qiáng)豬只的適應(yīng)性，從而緩解豬只的應(yīng)激反應(yīng)。建議豬場(chǎng)在接種完疫苗后，對(duì)豬只進(jìn)行3～5 min觀察，如果出現(xiàn)應(yīng)激，通過(guò)扎鼻子、揉肚子、潑涼水等物理方式進(jìn)行搶救；嚴(yán)重應(yīng)激可肌內(nèi)注射腎上腺素或地塞米松進(jìn)行搶救。非洲豬瘟常態(tài)化如何減少豬群的應(yīng)激，重構(gòu)豬群的免疫程序，鑒于此，結(jié)合本公司豐富可靠的產(chǎn)品，提出了“一針三防”的理念，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證及臨床應(yīng)用研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于本公司產(chǎn)品線建立的“一針三防”效果非常理想。70日齡時(shí)免疫口蹄疫(口蹄疫首免)，豬瘟(豬瘟二免)，偽狂寧(首次肌內(nèi)注射)。同時(shí)設(shè)單個(gè)疫苗對(duì)照組，免疫前、免疫后30 d對(duì)比抗體的變化，評(píng)估方案的可行性。具體操作，口蹄疫疫苗作為稀釋液稀釋偽狂犬病毒疫苗，然后再稀釋豬瘟病毒疫苗，后進(jìn)行免疫。通過(guò)方法創(chuàng)新形成口蹄疫-偽狂犬病-豬瘟三聯(lián)苗，進(jìn)行1次注射免疫即可。

3.3 “一針三防”組合免疫 林文耀等[7]通過(guò)口蹄疫抗體水平分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)免疫效果與聯(lián)合免疫效果相當(dāng)，即聯(lián)合免疫組(口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病)注入豬體后不影響口蹄疫免疫效果，特別是聯(lián)合免疫組二免后30 d口蹄疫效果幾乎不受影響。豬瘟抗體水平分析，免疫前抗體水平與一免后30 d、二免后30 d差異不顯著；各組之間比較差異不顯著，說(shuō)明聯(lián)合免疫不影響豬瘟免疫效果。偽狂犬病抗體分析，聯(lián)合免疫組一免后30 d、二免后30 d的效果與免疫前差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明免疫后偽狂犬病抗體快速提升，保護(hù)力提高。

綜上所述，3種疫苗同時(shí)免疫后，豬瘟和偽狂犬有免疫協(xié)同的作用，口蹄疫抗體無(wú)顯著差異，說(shuō)明“一針三防”是可行的。聯(lián)苗共同刺激動(dòng)物的免疫器官后有提高免疫應(yīng)答的作用，口蹄疫疫苗的油佐劑兼具抗原緩慢釋放的同時(shí)有免疫增強(qiáng)的作用。但必須意識(shí)到，不同廠家生產(chǎn)的疫苗因其生產(chǎn)工藝、佐劑類型不同，組合免疫效果差異極大。本試驗(yàn)是基于本公司產(chǎn)品的基礎(chǔ)上進(jìn)行的組合免疫應(yīng)用方案，該方案的結(jié)論不適用于其他廠家的疫苗產(chǎn)品與本公司產(chǎn)品進(jìn)行組合免疫，同樣也不適用于其他廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行組合免疫。“一針三防”的好處是口蹄疫+豬瘟+偽狂犬病同時(shí)免疫而不影響各自的免疫應(yīng)答，可以有效減少免疫次數(shù)，減少人和豬的接觸頻率，減少人工勞力，有效降低豬只的應(yīng)激，提高豬群抵抗力，70 日齡肌內(nèi)注射免疫，隨著母源抗體的衰退，可以有效減少母源抗體的干擾。本試驗(yàn)結(jié)果可為廣大養(yǎng)殖戶提供優(yōu)化免疫程序的參考依據(jù)。