四川樂山地區種鴨場沙門菌鑒定與耐藥性分析

尹 皚 ， 黃 毅 ， 韓和祥

(眉山職業技術學院農業技術系 ， 四川 眉山 620010)

沙門菌(Salmonella)可以引起雞、鴨、鵝、牛、羊、狐貍等多種動物及人發病，臨床中以急性、慢性或隱性感染為常見，該菌在禽類中主要通過水平傳播和垂直傳播，致使該病在禽類養殖過程廣泛流行，尤其對幼禽危害較大，感染率和死亡率均較高，成為禽類養殖過程中重要疾病之一[1]。國內相關研究表明，禽類是沙門菌儲存庫之一，該菌可以通過食品引起人食物中毒，經過統計每年沙門菌中毒可占細菌性食物中毒的42.6%以上，對人類危害較大[2-3]。鴨沙門菌病又叫鴨副傷寒，該病可以感染不同日齡的鴨，尤其對3周齡以內的雛鴨最易感，臨床主要以急性和亞急性癥狀為常見，感染率和死亡率與幼禽的日齡密切相關[4]。相關研究表明，沙門菌具有2 600 多種的血清型，其中感染鴨的沙門菌常見血清型主要有鴨沙門菌、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等[5]。抗生素是控制沙門菌感染有效的手段，在養殖過程中抗生素的超劑量濫用，導致沙門菌病出現了耐藥性增強和多重耐藥增高的變化趨勢，對人類的健康存在潛在危害，應該引起重視[6]。本試驗于2019—2020年從四川樂山地區種鴨場采集種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份并進行沙門菌分離和鑒定，檢測沙門菌的血清型和耐藥性。本試驗為指導種鴨場沙門菌的用藥與防控提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019—2020年采集四川樂山地區種鴨場的種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份。

1.1.2 主要試劑 S.S.培養基、沙門菌顯色培養基、普通營養肉湯，均購自青島海波生物科技有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購自廣東環凱微生物科技有限公司；臨床中常用的獸用藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；沙門菌屬診斷血清，購自中國食品藥品檢定研究院；DL1 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司。常規儀器與試劑由本單位實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與培養 對疑似感染的沙門菌病料經過處理后，接種于S.S.培養基37 ℃培養12 h后，挑取S.S.培養基單個菌落接種于沙門菌顯色培養基，37 ℃培養12 h，染色鏡檢觀察其形態學。

1.2.2 細菌生化鑒定 按照說明書方法對分離菌株進行生化特性檢測與鑒定。

1.2.3 細菌PCR鑒定 參考文獻[7]，根據GenBank中發表的序列，針對沙門菌invA和hut基因 (AE014613.1) 設計 2 對特異性引物，設計鑒定引物invA，5′- CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′，5′- T-GCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′,目的片段大小為185 bp；hut：5′-ACTGGCGTTATCCCTTTCTCTGC-3′，5′-ATGTTGTCCTGCCCCTGGTAAGa-3′，目的片段大小為495 bp；引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。采用細菌DNA試劑盒以提取菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，PCR產物測序，測序結果與GenBank中沙門菌株進行同源性比對。

1.2.4 血清型檢測 參考文獻[8]報道的方法，采用Kauffmann-White法對分離的沙門菌進行血清型檢測。

1.2.5 藥敏試驗 藥敏試驗參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行，分析分離菌株的耐藥性。

2 結果

2.1 細菌的分離和鑒定 疑似沙門菌分離菌株在S.S.培養基上長出圓形、邊緣整齊、灰白色的菌落，個別的菌落產硫化氫，呈中間黑心菌落；沙門菌顯色培養基上長出邊緣整齊、大小一致的紫色菌落。染色鏡檢進行形態學觀察，分離菌株為兩端鈍圓、無莢膜的陰性短桿菌。分離的75株疑似沙門菌的菌株生化鑒定均為沙門菌。

2.2 細菌PCR鑒定 對分離的菌株用引物invA和hut進行PCR鑒定，結果顯示，分離的75株菌株均擴增出大約為185 bp 和495 bp的目的條帶(圖1)。測序結果表明，分離的75株菌株均鑒定為沙門菌。

圖1 75株分離菌株的PCR鑒定結果Fig.1 PCR results of 75 isolated strainsM:DL1 000 marker； 1～15：分離菌株； 16：空白對照M:DL1 000 marker; 1-15: Isolated strain; 16:Blank control

2.3 血清型檢測 用Kauffmann-White法對分離的種鴨源沙門菌進行血清型鑒定，結果顯示，分離的75株沙門菌分別屬于12種血清型，其中禽傷寒沙門菌(25.3%)、鴨沙門菌(20.0%)、腸炎沙門菌(17.3%)3種血清型為該地區的流行優勢血清型(表1)。

表1 75株沙門菌分離株的血清型檢測結果Table 1 Serotype results of 75 Salmonella isolates

2.4 藥敏試驗與多重耐藥性分析 由表2可知，分離的75株沙門菌耐藥性嚴重，對阿莫西林、氨芐西林等9種藥 物耐藥率較高，耐藥率介于77.3%～98.7%；對多西環素、環丙沙星、氨曲南等5種藥物的耐藥率介于45.3%～64.0%；對頭孢曲松、頭孢噻呋、恩諾沙星、林可霉素4種藥物的耐藥率較低，介于13.3%～22.7%。

表2 75株沙門菌分離株的藥敏試驗結果Table 2 Drug sensitivity results of 75 Salmonella isolates

由表3可知，臨床中分離的75株沙門菌呈現多重耐藥性，耐 17 種藥物有 1 株、耐 16、7 種藥物各 3 株、耐 15、9、6種藥物各 4 株、耐 14、8 種藥物各有 6 株、耐13種藥物有 5株，耐 12、11、10 種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的 16.0%、18.7%和17.3%。

表3 75株沙門菌多重耐藥性檢測結果Table 3 Detection of multidrug resistance of 75 Salmonella strains

3 討論

沙門菌是臨床中重要的人獸共患病原菌，該菌血清型眾多，我國共報道約290種血清型，對動物和人類的危害比較大，雞和鴨是主要食源性動物，是人類感染沙門菌主要的來源之一，沙門菌病已經嚴重威脅到人類的健康，應引起重視[9-10]。近年來，關于沙門菌感染的報道逐漸增多，嚴重影響我國禽類養殖業的發展。任士飛等[7]報道從徐州及周邊地區分離得到49 株鴨源沙門菌，以印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌為主要流行優勢血清型。張林吉[2]報道了在徐州地區分離的26株鴨源沙門菌以腸炎沙門菌為主。許明等[11]研究表明，從江蘇地區分離的 33 株沙門菌以查理沙門菌血清型為主。本試驗結果表明，2019—2020年從四川樂山地區種鴨場采集種鴨肛拭子、死胚、病死雛鴨等病料組織204份，分離得到75株沙門菌，分離的沙門菌屬于12種血清型，以禽傷寒沙門菌、鴨沙門菌、腸炎沙門菌為流行優勢血清型。本試驗與上述報道的鴨源血清型存在一定差異性，可能與地區有關，不同地區流行的血清型也不一樣。鴨場沙門菌廣泛流行與傳播方式有關，該菌既能水平傳播，又能垂直傳播，種鴨通過卵傳播給下一代，導致該菌在養殖場中廣泛發生與流行[12]。因此，規模化養殖場應該注重該病的防控與凈化，減少該病發生。

近年來，養殖場中由于抗菌藥物不合理使用，導致沙門菌耐藥菌株逐漸增多，出現多重耐藥菌株，給該病的防控帶來了一定難度，且沙門菌耐藥性可以通過食物在人和動物中傳播，給人類的健康造成潛在的威脅[12]。本試驗表明，分離的75株沙門菌對臨床常用抗生素耐藥性較嚴重，對阿莫西林、氨芐西林、鏈霉素等13種藥物耐藥率在45.3%以上，出現多重耐藥性，其中耐 12、11、10 種藥物分離菌株最多。說明從四川樂山地區種鴨場分離的沙門菌耐藥性較強，呈現多重耐藥性。與張林吉等[4]、任士飛等[7]、常江等[13]報道的存在一定的差異性，可能與地區、藥物使用情況有關。因此，在規模化養殖場中應該注重抗生素的合理使用。本試驗為四川樂山地區種鴨場沙門菌防控提供參考依據。