膽翹注射液中主要質量指標成分的定性和定量方法的建立

呂 利 ， 謝 穎,2 ， 林柏良 ， 鄧招游 ， 鄧銳涵 ， 彭健波 ， 吳文健 ， 陶 卿 ， 何家康,

(1. 廣西大學動物科學技術學院 ， 廣西 南寧 530005 ； 2. 廣西壯族自治區動物疫病預防控制中心， 廣西 南寧 530001 ; 3. 廣西獸藥制劑工程技術研究中心 ， 廣西 南寧 530003)

動物膽汁具有抗菌、抗炎、解熱鎮痛、抗氧化等多種藥理活性，膽汁酸為膽汁的主要成分[1-2]。黃芩是中醫臨床的常用藥之一，具有清熱燥濕、解毒等功效[3]，在現代醫學中，黃芩具有抗菌[4]、抗病毒[5]、抗炎[6]、抗過敏[7]、抗氧化[8]等藥理作用。連翹味苦、性微寒，有清熱止吐、除濕退黃、清肝利膽等作用[9]，現代藥理研究表明，連翹具有廣譜抗菌、抗炎、解熱、利尿的作用[10-12]。中藥注射劑是從藥材中提取有效成分并純化后，制成的可注入機體的溶液、乳狀液及臨用前配制為溶液的粉末或濃溶液的無菌制劑[13]。中藥注射劑是現代科學技術與傳統中醫藥理論相結合的產物，可直接注入體內，吸收快，定位準確，療效高，可以治療許多急、慢性病例或危重病例，可充分發揮中藥的優點[14]。

膽翹注射液是由膽膏、黃芩提取物和連翹提取物經加工制成的中藥注射劑，具有清肺止咳、消炎利膽等多種功效。本試驗旨在建立膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的薄層鑒別方法，以及膽膏、黃芩提取物含量測定的高效液相色譜(HPLC)分析方法，為膽翹注射液質量標準的制定提供方法學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 ZF-20D暗箱式紫外分析儀，購自上海寶山顧村電光儀器廠；939型全自動薄層制板器，購自重慶南岸貝爾德儀器技術廠；ZDX-35BI自動座式壓力蒸汽滅菌鍋，購自山東新華醫療器械股份有限公司；BP211D 電子分析天平，購自德國賽多利斯集團；LC-20A高效液相色譜儀，購自日本島津制作所，配備有SPD-M20A檢測器和DAD、SIL-20A自動進樣器和柱溫箱；TU-1901紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責任公司；B3200S-T超聲儀，購自必能信超聲(上海)有限公司；CD-UPT-П-20L超純水儀，購自成都越純科技有限公司。

1.2 藥品與試劑 甲醇、乙腈為色譜級，其他試劑為分析純，水為超純水；膽膏，其藥材基原膽汁為豬科動物Sus scrofa domesticus Briss.，經乙醇處理獲得稠膏狀物，膽膏的標準符合《獸藥國家標準》化學藥品、中藥卷第一冊“膽膏”項下規定，產地廣西；黃芩提取物(含黃芩苷86.9%)、連翹提取物(含連翹苷1.98%)，均購自四川恒瑞通達生物科技有限公司；三批膽翹注射液中試樣品(批號：20150601、20150602和20150603)、缺膽膏的膽翹注射液陰性樣品、缺黃芩提取物的膽翹注射液陰性樣品、缺連翹提取物的膽翹注射液陰性樣品，由廣西北斗星動物保健品有限公司提供；豬去氧膽酸對照品(中國食品藥品檢定所研究院，純度：TLC時99.5%，HPLC時97.5%，批號：100087～200610)；鵝去氧膽酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，純度：98.3%，批號：110806～201708)；黃芩苷對照品(中國食品藥品檢定所研究院，批號：110715～201714)。

1.3 薄層色譜(TLC)鑒別

1.3.1 膽膏的鑒別 精密量取膽翹注射液10 mL，置50 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置立式滅菌鍋中，于120 ℃、壓力103 kPa加熱4 h，放冷，用鹽酸調節pH至6～7，移至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液50 mL，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺膽膏的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取豬去氧膽酸對照品、鵝去氧膽酸對照品，分別加無水乙醇制成每1 mL各含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述藥液各5 μL，于同一硅膠G薄層板上點樣，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰乙酸-水(10∶5∶3∶5∶1,v/v/v/v/v)的上層溶液(臨用配置)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰顯色視檢。

1.3.2 黃芩提取物的鑒別 取膽翹注射液1 mL，加甲醇9 mL，搖勻，作為供試品溶液；取缺黃芩提取物的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取上述藥液各2 μL， 于同一聚酰胺薄膜點樣，以醋酸為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰顯色視檢。

1.3.3 連翹提取物的鑒別 取膽翹注射液60 mL，加乙酸乙酯振搖(輕搖)提取3次(60 mL、50 mL、40 mL)，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇5 mL使溶解，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g，拌勻，加置中性氧化鋁柱(100～200目，1 g，內徑1～1.5 cm)上，用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺連翹提取物的膽翹注射液陰性樣品，按上述方法制得陰性樣品液；另取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述藥液各2～5 μL，于同一硅膠G薄層板上點樣，以三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(17∶2∶1,v/v/v)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點清晰顯色視檢。

1.4 膽膏含量測定

1.4.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：乙腈-0.1%冰乙酸(50∶50)；流速：1 mL/min；檢測器：蒸發光散射檢測器；進樣量：對照品溶液5 μL和10 μL，供試品溶液10 μL；理論板數按豬去氧膽酸峰計算應不低于7 000。

1.4.2 對照品溶液的制備 分別取豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對照品適量，精密稱定，各加入甲醇，分別制得0.625 mg/mL的對照品貯備液，備用。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密量取本品10 mL，置50 mL錐形瓶中，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，用牛皮紙將瓶口蓋上，置立式滅菌鍋中，于120 ℃、壓力103 kPa加熱4 h，放冷，用鹽酸調節pH至6～7，移至100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

1.4.4 專屬性試驗 取豬去氧膽酸對照品、鵝去氧膽酸對照品、供試品、陰性樣品，在“1.4.1” 項色譜條件下進樣檢測。

1.4.5 線性關系考察 分別配制濃度為0.125、0.250、0.375、0.500 mg/mL和0.625 mg/mL的豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對照品溶液，在“1.4.1”項色譜條件下進樣檢測。取“1.4.2”項下濃度均為0.625 mg/mL的豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸對照品溶液，加甲醇稀釋，進樣測定，記錄色譜圖。

1.4.6 重復性試驗 精密量取同一批次注射液樣品6份，按“1.4.3”項下制備供試品溶液，在“1.4.1”項下色譜條件進樣檢測。

1.4.7 穩定性試驗 精密量取同一批次注射液樣品適量，按“1.4.3 ”項下制備供試品溶液，于室溫下放置0、4、8、12、16、20 h和24 h后在“1.4.1”項色譜條件下進樣檢測。

1.4.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的供試品1.0 mL，平行6份，每份各精密加入豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸對照品貯備液4.0 mL，按“1.4.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.4.1” 項色譜條件下進樣檢測。

1.4.9 樣品含量測定 取三批樣品，按“1.4.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.4.1”項色譜條件下進樣檢測；另取對照品適量，同法測定，按外標法計算膽翹注射液中豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量。

1.5 黃芩提取物含量測定

1.5.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-水-冰乙酸(50/50/1)；體積流量：1 mL/min；檢測波長為274 nm；進樣量：10 μL。

1.5.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成濃度為0.750 mg/mL的對照品溶液，即得。

1.5.3 供試品溶液的制備 精密吸取供試品1 mL， 置100 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。

1.5.4 專屬性試驗 取黃芩苷對照品、供試品、陰性樣品，在“1.5.1” 項色譜條件下進樣檢測。

1.5.5 線性關系考察 分別配制濃度為0.075、0.150、0.225、0.300 mg/mL和0.375 mg/mL的黃芩苷對照品溶液，在“1.5.1” 項色譜條件下進樣檢測，以峰面積為縱坐標(y)，以黃芩苷對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(x)進行回歸分析。

1.5.6 重復性試驗 精密量取同一批次注射液樣品6份，按“1.5.3”項下制備供試品溶液，在“1.5.1” 項色譜條件下進樣檢測。

1.5.7 穩定性試驗 精密量取同一批次注射液樣品適量，按“1.5.3 ”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、4、8、12、16、20 h和24 h后在“1.5.1” 項色譜條件下進樣檢測。

1.5.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的膽翹注射液1.0 mL，平行6份，每份精密加入黃芩苷對照品溶液20 mL，按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項色譜條件下進樣檢測。

1.5.9 樣品含量測定 取3批樣品，按“1.5.3”項下方法制備供試品溶液，在“1.5.1”項色譜條件下進樣檢測；另取對照品適量，同法測定，按外標法計算膽翹注射液中黃芩苷的含量。

2 結果

2.1 膽膏、黃芩提取物、連翹提取物的鑒別 由圖1、2、3可知，供試品色譜在與對照品相應的位置上，顯相同顏色的斑點，背景清晰，分離效果好，無干擾，結果易判斷，符合薄層色譜系統適用性檢驗。

圖1 膽翹注射液中膽膏鑒別的薄層色譜分析Fig.1 TLC analysis of bile ointment in Danqiao injection1：缺膽膏的陰性樣品； 2：豬去氧膽酸對照品； 3：鵝去氧膽酸對照品； 4：批號20150601供試品； 5：批號20150602供試品；6：批號20150603供試品1:Negative sample without bile ointment; 2:Control substance of hyodeoxycholic acid; 3:Control substance of chenodeoxycholic acid; 4:Batch 20150601 of trial products; 5:Batch 20150602 of trial products; 6:Batch 20150603 of trial products

圖2 膽翹注射液中黃芩提取物鑒別的薄層色譜分析Fig.2 TLC analysis of scutellariae extract in Danqiao injection1：黃芩苷對照品； 2：缺黃芩提取物的陰性樣品； 3：批號20150601供試品； 4：批號20150602供試品； 5：批號20150603供試品1:Control substance of baicalin; 2:Negative sample without scutellaria extract; 3:Batch 20150601 of trial products; 4:Batch 20150602 of trial products; 5:Batch 20150603 of trial products

圖3 膽翹注射液中連翹提取物鑒別的薄層色譜分析Fig.3 TLC analysis of weeping forsythia extract in Danqiao injection1：缺連翹提取物的陰性樣品； 2：連翹苷對照品； 3：批號20150601供試品； 4：批號20150602供試品； 5：批號20150603供試品1:Negative sample without weeping forsythia extract; 2:Control substance of weeping forsythia; 3:Batch 20150601 of trial products; 4: Batch 20150602 of trial products; 5: Batch 20150603 of trial products

2.2 膽膏含量測定

2.2.1 專屬性試驗 如圖4所示，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的保留時間分別為10.749 min和22.655 min，處方中其他藥味對測定無干擾，說明該方法的專屬性良好。

圖4 膽翹注射液的高效液相色譜分析Fig.4 HPLC analysis of Danqiao injectionA：豬去氧膽酸對照品溶液； B：鵝去氧膽酸對照品溶液； C：供試品溶液； D：缺膽膏的陰性樣A:Control solution of hyodeoxycholic acid; B:Control solution of chenodeoxycholic acid; C:Test solution; D:Negative sample without bile ointment

2.2.2 線性關系 以峰面積的對數為縱坐標(y)，以豬或鵝去氧膽酸對照品濃度(mg/mL)的對數為橫坐標(x)進行回歸分析，得豬去氧膽酸的回歸方程為y=1.63x+5.48，R2=0.999 9，鵝去氧膽酸的回歸方程為y=1.66x+5.17，R2=0.999 2，表明豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸在0.125～0.625 mg/mL范圍內時，與峰面積呈良好的線性關系。當信噪比S/N 為3∶1時，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的檢測限分別為7.81 μg/mL和31.25 μg/mL；當信噪比S/N為10∶1時，豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的定量限分別為26.04 μg/mL和104.17 μg/mL。

2.2.3 重復性試驗 測得豬去氧膽酸的平均含量為2.83 mg/mL，RSD=0.41%(n=6)；鵝去氧膽酸的平均含量為2.30 mg/mL，RSD=0.30%(n=6)，表明該方法的重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 測得豬去氧膽酸的平均峰面積為1 639 762.43，RSD=0.45%；鵝去氧膽酸的平均峰面積為656 498.71，RSD=0.58%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.2.5 回收率試驗 如表1所示，豬去氧膽酸的平均回收率為100.07%，RSD=0.77%(n=6)；鵝去氧膽酸的平均回收率為100.58%，RSD=0.72%(n=6)，表明該方法的準確度良好。

表1 膽翹注射液的加樣回收率試驗結果(豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸)Table 1 Test results of sample recovery rate of Danqiao injection (Hyodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid) (n=6)

2.2.6 樣品含量測定 3批樣品中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量測定結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸)Table 2 Determination results of sample contents(Hyodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid) (mg/mL，n=3)

2.3 黃芩提取物含量測定

2.3.1 方法專屬性 如圖5所示，黃芩苷的保留時間為7.675 min，處方中其他藥味對該項定量測定無干擾，說明該方法的專屬性良好。

圖5 膽翹注射液的高效液相色譜分析Fig.5 HPLC analysis of Danqiao injectionA：黃芩苷對照品溶液； B：供試品溶液； C：缺黃芩提取物的陰性樣品A:Control solution of baicalin; B:Test solution; C:Negative sample without scuteuaria extract

2.3.2 線性關系 以峰面積為縱坐標(y)，以黃芩苷對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(x)進行回歸分析，得回歸方程為y=3 120 496.6x+45 046，R2=0.999 9。結果表明黃芩苷在0.075～0.375 mg/mL范圍內時，與峰面積呈良好的線性關系。

2.3.3 重復性試驗 測得黃芩苷的平均含量為15.70 mg/mL，RSD=0.27%，表明該方法的重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 測得黃芩苷的平均峰面積為5 434 367.14，RSD=1.28%，表明供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.3.5 回收率試驗 如表3所示，加樣回收率試驗測得黃芩苷的平均回收率為101.71%，RSD=1.00%(n=6)，表明該方法用于膽翹注射液中黃芩苷含量測定的準確度良好。

表3 膽翹注射液的加樣回收率試驗結果(黃芩苷)Table 3 Test results of sample recovery rate of Danqao injection (Baicalin) (n=6)

2.3.6 樣品含量檢測 3批樣品中黃芩苷的含量測定結果見表4。

表4 樣品含量測定結果(黃芩苷)Table 4 Determination results of sample contents (Baicalin) (mg/mL，n=3)

3 討論

3.1 關于膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的薄層鑒別 TLC在中藥質量控制中具有直觀、顯著的優勢，可同時分離多種樣品，固定相和流動相的選擇與變換靈活大，操作簡單，分離速度快[16-17]。本試驗參照《中國藥典》(2015年版一部)[18]收載的藥材豬膽粉質量標準中的薄層鑒別方法、《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的黃芩提取物質量標準中的薄層鑒別方法、《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的連翹提取物質量標準中的薄層鑒別方法，進行三批中試生產膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物、連翹提取物的薄層鑒別，結果各個TLC色譜圖背景清晰，分離效果好，陰性樣品無干擾，易判斷，具備專屬性，符合薄層色譜系統適用性檢驗。結果表明該項定性鑒別方法對供試品的處理及展開系統的選擇是合理的，可作為膽翹注射液中膽膏、黃芩提取物和連翹提取物的鑒別方法。

3.2 關于膽膏與黃芩提取物的高效液相色譜條件的確定 HPLC具有壓力高、速度快、效率高、靈敏度高等特征，特別是在對高沸點、受熱后性能不穩定或是分子量較大的中藥樣品進行測定和分析時有獨特的優勢[18-19]。由于豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸屬甾體類化合物，僅在紫外末端有弱的吸收，不適合用紫外檢測器檢測，因此本試驗選用蒸發光檢測器進行檢測[20]。本文參照《中國藥典》(2015年版一部)[21]

收載的藿膽片質量標準中膽酸及相關文獻[20]的含量測定方法，并經過多次重復試驗，篩選、優化、驗證，最終確定膽翹注射液中膽膏含量測定的色譜條件。對黃芩苷對照品溶液進行紫外掃描(掃描范圍190～400 nm)，結果表明，黃芩苷在274 nm處有明顯的強吸收，因此本試驗選用274 nm作為檢測波長，其他色譜條件參照《中國獸藥典》(2015年版二部)[15]收載的銀黃提取物注射液黃芩提取物含量測定方法，進行多次篩選、驗證，最終確定膽翹注射液中黃芩提取物含量測定的色譜條件。試驗結果顯示，所建立的定量分析方法簡便、快速、專屬性強、重現性和準確度好，可作為膽翹注射液中指標成分豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸及黃芩苷的含量測定方法。