奶牛布魯氏菌病6種血清學(xué)檢測方法對(duì)比試驗(yàn)

馬貴達(dá) ， 張若曦 ， 顧文源 ， 馬宏偉 ， 劉天駒 ， 孫泰然 ， 李春國 ， 程麗華 ， 邊青巖 ， 石興亞 ， 路廣計(jì)

(1.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 河北 石家莊 050035 ； 2.河北省保定市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 河北 保定 071027 ； 3.河北省唐山市玉田縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 河北 玉田 064100 ；4.河北省衡水市饒陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 ， 河北 饒陽 053900)

布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱“布病”)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病，在世界各地牛、羊養(yǎng)殖地區(qū)均有發(fā)生，其發(fā)病主要特征為懷孕母畜流產(chǎn)、不孕、乳腺炎 ； 公畜睪丸炎、不育等[1]。人感染布病后，其主要臨床癥狀為發(fā)熱(波狀熱、低熱)、乏力、大汗、關(guān)節(jié)炎等，嚴(yán)重的病人可導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)損傷等其他功能障礙[2-3]。目前，在我國布病最為流行的動(dòng)物是牛和羊，主要傳染源是帶菌和患病動(dòng)物，尤其是患病妊娠母畜在流產(chǎn)或分娩時(shí)排出的羊水、胎衣和胎兒，攜帶了大量布魯氏菌，成為傳播本病的最大隱患[4]。布病在我國已經(jīng)流行多年，經(jīng)長期防治雖得到有效控制，但近年來由于集約化奶牛養(yǎng)殖規(guī)模驟增，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，尤其是在我國畜牧業(yè)較為發(fā)達(dá)的北方地區(qū)，人間布病的發(fā)生與動(dòng)物布病的發(fā)生呈現(xiàn)正相關(guān)性，因此，科學(xué)防控布魯氏菌病對(duì)人民群眾食用放心乳制品、肉制品及畜牧業(yè)的健康發(fā)展有著重要意義[5-6]。

目前，我國有效防控和凈化布魯氏菌病的主要措施是疫苗免疫和血清學(xué)診斷，然而疫苗免疫抗體對(duì)血清學(xué)診斷存在一定干擾影響，無法準(zhǔn)確判定檢測結(jié)果[7-8]。目前，我國奶牛普遍使用A19株疫苗和S2疫苗，前者來源于牛種布魯氏菌，后者來源于豬種布魯氏菌。因此，本試驗(yàn)結(jié)合臨床上常用的A19和S2布魯氏菌疫苗，通過免疫試驗(yàn)牛，利用虎紅平板凝集試驗(yàn)(Rose bengal plate test,RBT)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,cELISA)、乳汁間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Milk indirect enzyme-linked immunosorbent assay,mELISA)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Agar diffusion test,AGID)和布病檢測試紙卡6種方法進(jìn)行檢測，綜合對(duì)比6種檢測方法對(duì)A19疫苗免疫群(注射)和S2疫苗免疫群(口服)的陽性檢出率，以期摸索出適用于規(guī)模化奶牛場布魯氏菌病凈化的檢測方法，為奶牛布魯氏菌病的準(zhǔn)確診斷和科學(xué)防控提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在選定規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場，采用RBT、iELISA和cELISA三種方法對(duì)牛群平行檢測，其檢測結(jié)果均為陰性的作為假定布病陰性(健康)試驗(yàn)牛，結(jié)果均為陽性的作為假定布病陽性(感染)試驗(yàn)牛；共篩選出40頭奶牛作為試驗(yàn)用牛，其中20頭 布病陰性后備奶牛、10頭布病陰性泌乳奶牛和10頭布病陽性泌乳牛，記錄耳標(biāo)編號(hào)進(jìn)行分組。

1.2 主要試劑 布魯氏菌疫苗：A19疫苗(18941002)、S2疫苗(18939003)，均購自金宇保靈生物藥品有限公司；虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(20170810)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布魯氏菌間接ELISA試劑盒(110917)、布魯氏菌乳汁檢測間接ELISA試劑盒(100717)、布魯氏菌競爭ELISA試劑盒(050318)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗體檢測試劑盒(020218)，均購自INGEZIM公司；布病檢測試紙卡(G180418311)，購自上海快靈生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀(安圖實(shí)驗(yàn)儀器鄭州有限公司，型號(hào)PHOMO)；隔水恒溫箱(上海智城分析儀器制造有限公司，型號(hào)ZXGP-A2270)；微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.4 免疫試驗(yàn) 將20頭布病陰性后備牛分為2個(gè)組， 每組10頭，分別為A19注射免疫組和S2口服免疫組；10頭布病陰性泌乳牛和10頭布病陽性泌乳牛均口服S2疫苗進(jìn)行免疫，按照分組免疫(表1)將試驗(yàn)牛分欄飼養(yǎng)，記錄并觀察牛群狀態(tài)。

表1 免疫試驗(yàn)分組Table 1 Immunological experiment group

1.5 樣品采集 在首次免疫當(dāng)天及免疫后15、30、60、90、120、150、180、210 d和240 d，對(duì)選定后備奶牛、泌乳牛頸靜脈采集5 mL血液樣品，分離血清；對(duì)試驗(yàn)泌乳牛采集5 mL牛奶樣品，-20 ℃冷凍保存，以備檢測。

1.6 檢測方法 RBT方法，按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646—2018)進(jìn)行操作與結(jié)果判定；iELISA、mELISA、cELISA、AGID和布病檢測試紙卡，均按照試劑盒所提供說明書進(jìn)行操作與結(jié)果判定，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 后備牛A19疫苗免疫抗體陽性率對(duì)比分析 經(jīng)注射免疫A19疫苗的后備牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、AGID和布病檢測試紙卡5種方法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖1)，5種檢測方法在免疫后90 d內(nèi)均可檢出陽性，陽性檢出率由高到低依次為布病檢測試紙卡、iELISA、RBT、AGID-LPS(陽性為免疫抗體)，其中RBT、iELISA、cELISA方法在免疫后15～30 d陽性率為100%，隨后呈下降趨勢；但cELISA陽性率在免疫后150 d呈升高趨勢，與其他檢測方法陽性檢出率趨勢相反。

圖1 后備牛A19疫苗免疫后不同檢測方法檢出率對(duì)比Fig.1 Comparison of detection rates of different detection methods in reserve cattle after immunized with A19 vaccine

2.2 后備牛S2疫苗免疫抗體陽性率對(duì)比分析 經(jīng)口服免疫S2疫苗的后備牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、AGID和布病檢測試紙卡5種方法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖2)，由于S2疫苗免疫誘導(dǎo)所產(chǎn)生抗體水平較低，RBT、AGID均無陽性檢出；iELISA、cELISA和檢測試紙卡均可檢出陽性，其中免疫后30 d iELISA方法檢出率最高達(dá)90%，后備奶牛S2疫苗免疫抗體檢測靈敏度顯著高于檢測試紙卡；而cELISA方法在免疫180 d后有陽性檢出。

圖2 后備牛S2疫苗免疫后不同檢測方法檢出率對(duì)比Fig.2 Comparison of detection rates of different detection methods in reserve cattle after immunized with S2 vaccine

2.3 陰性泌乳牛S2疫苗免疫抗體陽性率對(duì)比分析 經(jīng)口服免疫S2疫苗的布病陰性泌乳牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、mELISA、AGID和布病檢測試紙卡6種方法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖3)，由于S2疫苗免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平較低，RBT、AGID均無陽性檢出；iELISA、cELISA和mELISA三種檢測方法均可檢出陽性，其中iELISA和mELISA在180 d內(nèi)有陽性檢出，且檢出率最高達(dá)80%，然而在60 d內(nèi)iELISA檢出率高于mELISA，60 d后檢出率趨勢相反；布病檢測試紙卡在30 d內(nèi)陽性檢出率最高，可達(dá)到83.3%，隨后檢出率下降，120 d無法檢出；此外，在免疫60 d后cELISA有陽性檢測，且陽性檢出率逐漸升高。

圖3 陰性泌乳牛S2疫苗免疫后不同檢測方法檢出率對(duì)比Fig.3 Comparison of detection rates of different detection methods in negative lactating cattle after immunized with S2 vaccine

2.4 陽性泌乳牛S2疫苗免疫抗體陽性率對(duì)比分析 經(jīng)口服免疫S2疫苗的陽性泌乳牛群，利用RBT、iELISA、cELISA、mELISA和AGID五種方法對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示(圖4)，5種方法均可檢出陽性，在免疫60 d內(nèi)，檢出率均為100%；綜合對(duì)比分析，iELISA檢測敏感度最高，RBT和mELISA檢測陽性率均在90%，免疫180 d 后檢出率開始降低，AGID-NH(陽性為感染抗體)在免疫120 d后檢出率開始降低；而cELISA檢出陽性率在免疫180 d后呈上升趨勢。

圖4 陽性泌乳牛S2疫苗免疫后不同檢測方法檢出率對(duì)比Fig.4 Comparison of detection rates of different detection methods in positive lactating cattle after immunized with S2 vaccine

2.5 布病檢測試紙卡符合率檢測 為了驗(yàn)證布病檢測卡的特異性和敏感性，對(duì)已知的20份布病陰性和10份陽性血清進(jìn)行定性檢測，結(jié)果顯示(表2)，布病檢測試紙卡陽性符合率(敏感性)100.00%，陰性符合率(特異性)90.00%，總符合率為93.33%。

表2 布病檢測試紙卡符合率檢測Table 2 Detection of conformity rate of Brucellosis test paper card

3 討論

布魯氏菌病的發(fā)生與傳播，不僅對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大危害，還對(duì)人類健康公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重威脅，因此早期診斷是有效控制本病的主要措施。在臨床上，由于受實(shí)驗(yàn)室條件的限制，難以開展布魯氏菌的分離鑒定工作，因此，血清抗體檢測作為一種操作簡便，具有敏感性高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[9-10]。

目前，診斷動(dòng)物布魯氏菌病的血清學(xué)方法較多，主要有RBT、試管凝集試驗(yàn)(Serum tube agglutination test,SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Completement fixation test,CFT)以及ELISA檢測法等[11]。現(xiàn)行國標(biāo)中SAT是確診布病的定性方法，但由于檢測程序繁瑣，敏感性和特異性較低等原因，在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)參考中已不再使用。CFT是OIE指定的國際貿(mào)易中布病的診斷方法，雖然其特異性強(qiáng)，但由于操作復(fù)雜，對(duì)檢測者要求高，往往會(huì)出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，對(duì)養(yǎng)殖場布魯氏菌病的凈化并不適用[12-13]。

本試驗(yàn)選用RBT、iELISA、cELISA、mELISA、AGID和布病檢測試紙卡6種檢測方法,對(duì)不同免疫群體進(jìn)行抗體檢測并比較分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同疫苗免疫群體中iELISA檢測方法均具有較高的敏感性和檢出率；布病檢測試紙卡對(duì)后備牛A19免疫抗體檢測最為敏感，在后備牛S2免疫后也有較高檢出率，但并未達(dá)到100%，免疫90 d后無法檢出；然而iELISA和布病檢測試紙卡對(duì)S2免疫抗體檢出率在各時(shí)期均未達(dá)到100%，并且在免疫60 d后陽性檢出率開始下降，RBT在后備牛A19免疫后和布病陽性泌乳牛S2免疫后有一定檢出率，但后備牛和陰性泌乳牛在S2疫苗免疫后，均無法檢出，其原因可能是A19疫苗株的毒力大于S2疫苗株，從而S2免疫群產(chǎn)生抗體的水平低于A19免疫群，A19疫苗肌內(nèi)注射的免疫效果優(yōu)于S2疫苗口服免疫，A19比S2誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫抗體水平更高、持續(xù)時(shí)間更長，綜合分析可能與S2疫苗免疫產(chǎn)生的抗體水平與消長規(guī)律具有相關(guān)性。mELISA在泌乳牛群中均有陽性檢出；AGID-LPS和AGID-NH在陽性泌乳牛群中有檢出，并能夠準(zhǔn)確鑒別感染抗體與免疫抗體，而AGID-LPS僅在后備牛免疫A19疫苗中有檢出；此外，cELISA檢測方法普遍在免疫后期有陽性檢出。

本試驗(yàn)6種檢測方法中，僅AGID能有效鑒別感染抗體和免疫抗體，在免疫60 d后檢出率降低，可能是因?yàn)楦腥九Ｔ谝呙缑庖吆箝_始轉(zhuǎn)陰所致。目前，AGID作為引進(jìn)的一種區(qū)分布魯氏菌自然感染抗體和疫苗免疫抗體的方法。AGID-LPS抗體與AGID-NH抗體均有檢出則為感染牛群，在陽性泌乳牛接種S2疫苗試驗(yàn)中得到驗(yàn)證；AGID-LPS抗體陽性、AGID-NH抗體陰性的為免疫牛，在陰性后備牛接種A19疫苗試驗(yàn)中得到驗(yàn)證；AGID-LPS抗體、AGID-NH抗體均為陰性的牛為未免疫或低免疫抗體的健康牛，在陰性后備牛免疫A19或S2疫苗、陰性泌乳免疫S2疫苗試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。因此，AGID方法可適用于布魯氏菌免疫背景不清或尚未超過免疫干擾期的牛群血清檢測。

4 結(jié)論

不同檢測方法對(duì)不同生長階段和免疫背景的奶牛抗體檢測能力存在差異。iELISA敏感性最高，其次為布病檢測試紙卡，二者均可適用于自然感染牛群的初篩及A19和S2疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)；此外，RBT也具有較高的敏感性，適用于自然感染牛的初篩及A19疫苗免疫效果的血清抗體評(píng)價(jià)，但并不適于S2免疫效果評(píng)價(jià)；在臨床布病初篩中，布病檢測試紙卡可替代RBT進(jìn)行檢測；mELISA適用于泌乳牛自然感染的初篩、免疫效果評(píng)價(jià)的乳清抗體檢測；cELISA是國際公認(rèn)的除CFT以外特異性最高的方法，適用于感染晚期確診，與iELISA二者相結(jié)合，則可適用于規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場的布魯氏菌病凈化；AGID適用于免疫背景不清或尚未超過免疫干擾期的牛群檢測，可有效區(qū)分自然感染抗體和疫苗免疫抗體，適用于布病的確診和規(guī)模化奶牛場的引種、凈化工作。