多重耐藥肺炎克雷伯菌裂解性噬菌體Kp-8329的分離鑒定和基因組分析

劉家齊 ， 于 新 ， 田 爽 ， 董長安 ， 黃紅蘭

(1. 吉林大學基礎醫學院 ， 吉林 長春 130021 ； 2. 吉林百合口腔醫院 ， 吉林 長春 130022)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是重要的條件致病菌之一，其導致的疾病在克雷伯菌中占比超過95%[1-2]，包括肺炎、腦膜炎和敗血癥等。近年來，由于大量使用氨基糖苷類等抗生素，導致耐藥菌的數量越來越多，耐藥率越來越高[3-5]。噬菌體是感染細菌、真菌等病毒的總稱，同時也是地球上數量最大的生物群體，是細菌數量的10倍。噬菌體進入宿主菌進行復制，使得宿主菌發生裂解，同時釋放大量子代噬菌體，可以考慮應用于細菌感染的治療。噬菌體自1896年被發現以來，探索過程并不是一帆風順，抗生素的廣泛使用使噬菌體慢慢淡出了人們的視野，近年來，抗生素耐藥情況越來越多，加之超級細菌的產生，使得人們越來越關注噬菌體。本試驗對肺炎克雷伯菌噬菌體進行分離，觀察其生物學特點，分析其遺傳信息，為今后應用噬菌體治療肺炎克雷伯菌感染提供數據支持，也為臨床治療起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料來源 肺炎克雷伯菌臨床分離株，來自吉林大學第二醫院，作為分離噬菌體的宿主菌，經質譜儀(型號為VITEK MS)鑒定，將其命名為8329。應用吉林大學第二臨床醫院檢驗科法國梅里埃藥敏鑒定儀器測定宿主菌8329對19種抗菌藥的敏感性，結果顯示該菌株對頭孢呋辛鈉、頭孢他啶、頭孢替坦、頭孢吡肟、亞胺培南、頭孢呋辛酯、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林8種抗菌藥全部不敏感，故為多重耐藥菌。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體Kp-8329的分離 采集吉林大學白求恩第一醫院污水中心未經處理的污水，離心取上清，加入1 mL肺炎克雷伯菌對數期菌液，50 mL 營養肉湯(NB)培養基，160 r/min 37 ℃培養7 h，4 ℃ 8 000 g離心30 min，用0.22 μm濾器過濾上清液。于試管中加入0.1 mL對數期菌液和0.1 mL上述濾液，混勻后室溫孵育10 min，采用雙層平板法[6]觀察是否有噬斑出現。

1.2.2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察 取20 μL純化后的噬菌體液滴至銅網，室溫下靜置15 min，滴加2%磷鎢酸染色15 min，透射電鏡觀察形態[7]。

1.2.3 噬菌體Kp-8329的生物學特性分析 雙層平板法[8]對噬菌體的一步生長曲線、最佳感染復數、溫度和pH穩定性進行測定。

1.2.4 噬菌體Kp-8329的DNA提取及測序 按噬菌體DNA抽提試劑盒說明書(北京艾德萊生物科技有限公司)提取噬菌體DNA，送生物公司測序。用Newbler 2.9軟件組裝基因組序列，使用RAST 2.0預測基因及功能注釋，用MEGA 6.0構建系統進化樹。

2 結果

2.1 噬菌體Kp-8329的分離 以肺炎克雷伯菌8329為宿主菌，噬菌體來自吉林大學白求恩第一醫院廢水，其噬斑形態均為圓形，如圖1所示，噬菌體Kp-8329可在菌苔上形成直徑3～5 mm，邊緣清晰，大小均一的圓形噬斑，在噬斑周圍有1個半透明的暈環，寬度約5 mm。

圖1 噬菌體Kp-8329的噬斑Fig.1 Plaque of phage Kp-8329

2.2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察 使用透射電鏡觀測噬菌體形態，如圖2所示，該噬菌體由對稱的多面體立體頭部和尾部組成，頭部直徑為45～50 nm，有1條 尾，長為130～140 nm。按照國際病毒分類委員會(ICTV)的分類規則，噬菌體Kp-8329屬于有尾噬菌體目、長尾病毒科噬菌體。

圖2 噬菌體Kp-8329的電鏡觀察Fig.2 Electron microscopy observation of phage Kp-8329

2.3 噬菌體Kp-8329的生物學特性

2.3.1 噬菌體Kp-8329的最佳感染復數(MOI) 通過雙層平板法對噬菌體MOI進行測定,MOI為0.01，如表1所示，即在噬菌體滴度和宿主菌濃度比值是0.01的情況下，能夠獲得最大量的噬菌體產物。

表1 噬菌體Kp-8329最佳感染復數測定Table 1 Determination of the optimal multiplicity of infection of phage Kp-8329

2.3.2 噬菌體Kp-8329的一步生長曲線 如圖3所示，Kp-8329感染宿主菌的潛伏時間大約為15 min；裂解期持續15 min；爆發量為147 PFU/cell。

圖3 噬菌體Kp-8329的一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of phage Kp-8329

2.3.3 噬菌體Kp-8329的溫度穩定性 如圖4所示，噬菌體Kp-8329的熱穩定性較強；40 ℃培養60 min后，滴度未出現明顯的改變；在60 ℃作用60 min后，噬菌體滴度略下降；當溫度達到80 ℃時，噬菌體幾乎完全失活。

圖4 噬菌體Kp-8329的溫度穩定性Fig.4 Temperature stability of phage Kp-8329

2.3.4 噬菌體Kp-8329的pH穩定性 如圖5所示，當pH為5～12時，噬菌體Kp-8329有較高的活力；pH為4時，存活率有所下降；而pH在1～3和13～14 變化時，噬菌體均失活。

圖5 噬菌體Kp-8329的pH穩定性Fig.5 pH stability of phage Kp-8329

2.4 噬菌體Kp-8329全基因組概述 如圖6所示，Kp-8329基因組全長46 907 bp，G+C含量為46.90%，未檢出 tRNA 和 rRNA。根據美國國家生物信息中心(NCBI)的BLAST程序，針對開放閱讀框(ORF)來實施功能注釋，116個ORFs中有32個ORFs與數據庫中已經公開的功能蛋白有較高相似度，余下84個ORFs注釋為功能未知的假定蛋白，在噬菌體Kp-8329中未查出毒力因子和抗生素的耐藥基因，證明噬菌體Kp-8329在日后的臨床應用中存在一定的安全性。

圖6 噬菌體Kp-8329全基因組結構示意圖Fig.6 Schematic diagram of the whole genome structure of phage Kp-8329

2.5 噬菌體Kp-8329與同屬噬菌體的進化關系分析 如圖7所示，噬菌體Kp-8329的基因組的進化關系中，沒有查出和其進化關系相似的肺炎克雷伯菌噬菌體。

圖7 Kp-8329與同屬噬菌體的進化關系鄰接樹Fig.7 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship between Kp-8329 and the same phage箭頭：噬菌體Kp-8329所在進化樹分枝；下圖同Arrow: The branch of the evolutionary tree where the phage Kp-8329 is located.The same as beolw

2.6 噬菌體Kp-8329 DNA聚合酶基因的進化關系分析 如圖8所示，基于DNA聚合酶基因的進化關系表示，該噬菌體和大腸埃希菌屬噬菌體之間的進化關系十分相似。

圖8 Kp-8329 DNA聚合酶基因的進化關系鄰接樹Fig.8 Neighbor-joining tree of evolutionary relationship of Kp-8329 DNA polymerase gene

3 討論

近年來耐藥細菌的治療越來越困難，世界衛生組織(WHO)更是認為細菌耐藥是21世紀以后的最大難題之一[9]。噬菌體療法是有效解決抗生素耐藥性的候選者之一。但有些噬菌體攜帶耐藥基因或毒力基因，在臨床上不適用，所以，需要對其全基因組測序，了解其基因組結構和進化關系，為其今后應用提供數據支持[10]。

本試驗自醫院未經處理的污水中分離出噬菌體Kp-8329，該噬菌體是典型的有尾目噬菌體，潛伏期短，爆發量大，具有較高的酸堿穩定性，pH在5～12變化范圍內有較高的活力；對溫度的耐受性也較好。對這些生物學特性的分析表明，噬菌體Kp-8329 作為一種有效、可靠和特異的生物制劑，在治療臨床眾多感染，尤其是耐藥性肺炎克雷伯菌感染方面有著較為廣闊的發展前景和研究方向。

噬菌體Kp-8329基因組為線性雙鏈DNA，大小為46 907 bp，G+C含量為46.90%，未檢出 tRNA 和 rRNA，基因組中包含116個ORFs，32個ORFs可預測功能。按照功能不同可被劃分成3個部分：結構蛋白模塊，這些結構蛋白會在翻譯后期包裝組成完整的噬菌體結構，包括ORF18、ORF21、ORF29、ORF39、ORF42、ORF51、ORF63、ORF66、ORF74和ORF84；DNA 復制及組裝模塊，當噬菌體的遺傳物質進入細菌體內后，噬菌體會利用細菌進行自身的復制及組裝，這個模塊主要是DNA代謝所需的相關蛋白，包括ORF8、ORF9、ORF10、ORF15、ORF22、ORF34、ORF54、ORF56、ORF58、ORF59、ORF77、ORF79、ORF80、ORF85、ORF96、ORF105、ORF110、ORF111和ORF114；裂解宿主模塊，包括ORF17、ORF62和ORF72；其余為假定蛋白。深入分析上述ORFs的基因功能，可為噬菌體治療多重耐藥菌感染的研究提供科學依據。

通過已報道耐藥基因庫和毒力基因庫比對可以得出，噬菌體Kp-8329沒有耐藥基因和毒力基因，這表明噬菌體Kp-8329在基因組水平方面具有安全性。分析進化關系時，沒有發現和其進化關系十分相似的其他肺炎克雷伯菌噬菌體，而是與大腸埃希菌屬噬菌體有較為相近的進化關系。本試驗為今后的噬菌體基因組學、流行病學和噬菌體治療等研究提供基礎數據。