熱應激對蛋雞血清外泌體miRNA表達譜的影響

黃宇浩 , 高 文 , 崔艷峰 , 黃安琪 ， 吳 江 , 康 愷

(廣東海洋大學濱海農業學院 ， 廣東 湛江 524088)

蛋雞的集約化飼養環境面臨嚴峻的熱應激挑戰，尤其是我國華南地區，每年高溫持續時間長，濕度大。持續高溫導致蛋雞免疫力、采食量、產蛋率和蛋品質下降，嚴重時還會引起蛋雞死亡。外泌體是一種可由細胞分泌至細胞外，直徑在30～150 nm的膜性囊泡，其組成成分主要有蛋白質(受體、轉錄因子、酶)、脂質、核酸，核酸成分主要有信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環狀RNA(circRNA)。目前對外泌體的研究報告比較多，常見于外泌體內含物成分的分析、機體功能異常、病毒感染、各種疾病的分子標記，也作為多種信號的傳遞體，介導細胞與細胞之間信息交流[1-2]，國內對蛋雞外泌體尤其是蛋雞在熱應激條件下血清外泌體的濃度成分變化等報道少見。

動物在處于熱應激狀態時，除了相關的應激蛋白、應激激素及細胞因子會發生變化外，miRNA的表達也會出現改變，參與應激反應引起機體生理功能改變[2-3]。Cho等發現，熱應激處理后的小鼠結腸癌細胞分泌的外泌體中熱休克蛋白70(HSP70)的含量比未經處理的細胞高，而且外泌體能激活樹突狀細胞和巨噬細胞，觸發協同免疫反應，并能增強輔助性T 細胞 1 型免疫應答，清除腫瘤細胞[4]。利用外泌體與miRNA (miR-140)分子聯合，通過誘導膜融合，將miRNA釋放到骨髓干細胞質中，促進干細胞向軟骨細胞的分化，實現外泌體作為生物介質用于疾病治療[5]。鄭月等利用miRNA高通量測序技術在熱應激奶牛血清中，發現52個顯著差異表達的miRNA，其中通過分析發現miR-181a與免疫功能的調控密切相關，miR-19a和miR-19b與調控熱應激的發生有關，這些miRNA可視為診斷熱應激的候選生物標記物[6]。Guo等報道熱應激通過miRNA 調節Fas/FasL信號通路從而參與熱應激誘導的細胞凋亡[7]。另有研究表明，熱應激的畜禽通過miRNA 作用，對畜禽生產性能進行調控。Attia等采用基因芯片技術對能量處于負平衡狀態奶牛肝臟 miRNA 表達進行檢測時發現，miR-17-5p、miR-31、miR-140、miR-1281和miR-2885這5個miRNA表達上調[8]。

本試驗通過建立蛋雞的熱應激模型，分別對常溫對照組(Normal temperature control group,NC組)及高溫控制組(High temperature control group,HC組)進行血清外泌體分離鑒定，并測定血清外泌體濃度變化。利用miRNA 高通量測序技術和熒光實時定量PCR技術，分析差異表達的miRNA，并分析其在熱應激和抗熱應激過程中所涉及的通路，為研究外泌體miRNA調控蛋雞熱應激反應的機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol，購自天根生化科技(北京)有限公司；外泌體提取試劑盒(76064)，購自凱杰生物工程(深圳)有限公司；PrimeScriptTMRT 反轉錄試劑盒、SYBGREEN Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 冷凍離心機，Sigma公司產品；透射電子顯微鏡，日本JEM產品；熒光定量PCR儀，美國伯樂產品。

1.3 試驗動物 羅曼粉殼蛋雞雞苗，購自廣東喜迎珍禽有限公司，飼養于廣東海洋大學動物醫院動物房。蛋雞育成及飼養管理參照Lohmann Tieraucht Gmb H手冊(https://lohmann-breeders.com/)。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗動物分組 選取40周齡健康狀況良好、生產性能相近的羅曼粉殼蛋雞40只，隨機分為兩組，常溫對照組(NC組)保持雞舍處于(25±3)℃，高溫控制組(HC組)環境溫度控制在(32±3)℃，采用空調、除濕機等嚴格控制環境溫濕度，進行飼養試驗。3層階梯籠養，每籠3只雞。每天投料2次， 上午8：00和下午18：00各1次，自由飲水和采食。光照設置：采用自然光照和人工補光結合的方法，控制16 h光照。飼養持續1個月。

1.4.2 血清的制備與外泌體的提取 NC組和HC組分別取10只蛋雞，進行采血，每只5 mL，凝血后離心分離血清，混合血清提取外泌體。按照Qiagen外泌體提取試劑盒(76064)說明書步驟進行操作。

1.4.3 透射電鏡鑒定外泌體形態 將提取的外泌體用250 μL PBS稀釋，用移液器槍頭吹打混勻后，取稀釋液10 μL滴于載樣銅網上，室溫靜置5 min， 用濾紙將多余液體吸去。用3%磷鎢酸鈉溶液負染3 min，室溫晾干，在透射電鏡下觀察并拍照(于廣東醫科大學透射電鏡室完成)。

1.4.4 外泌體miRNA 表達譜及粒徑檢測 將提取的外泌體送杭州聯川生物科技有限公司進行miRNA 表達譜檢測及粒徑分析(Nanoparticle tracking analysis，NTA)。

1.4.5 熒光定量PCR TRIzol裂解外泌體，常規方法提取總RNA，利用PrimeScriptTMRT 試劑盒反轉錄成 cDNA，并利用 SYBGREEN Mix試劑盒進行RT-PCR 反應，其中5S rRNA基因作為參照(引物信息見表1)。定量PCR體系(20 μL)：ddH2O 8 μL、SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物(10 μmol/L)(序列信息見表1)各0.5 μL。反應程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s；退火：50～60 ℃ 30 s；延伸：72 ℃ 30 s，40個循環，72 ℃ 10 min。每個樣品3個重復。根據2-ΔΔCt法計算基因在各組中miRNA 的相對表達量。

1.4.6 引物設計與合成 對兩組樣品中差異表達的8個miRNA，設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4.7 統計分析 定量PCR數據依據公式2-△△Ct計算，以NC組相對均值為1作圖。采用t檢驗對試驗數據進行統計學分析，計量資料以平均值±標準差表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 血清外泌體形態鑒定 在對NC組及HC組蛋雞進行血清的分離及外泌體的提取后，利用透射電鏡對所提取的外泌體進行形態學鑒定。在透射顯微鏡下觀察HC組及NC組樣品，視野清晰，可見數個形態呈類球形，直徑約為70 nm，外部有雙層膜結構，內部有低密度物質的微小囊泡，形態、直徑符合外泌體的形態描述。兩組樣品外泌體形態相似，無明顯差別，多數外泌體呈單個分布，見圖1。

圖1 透射電鏡下血清外泌體形態Fig.1 Morphology of serum exosomes under transmission electron microscopeA: 常溫組(NC組)； B:高溫控制組(HC組)； 標尺：100 nmA: Normal temperature control group (NC group)； B: High temperature control group (HC group)； Bar:100 nm

2.2 血清外泌體濃度粒徑分析 經對血清外泌體NTA分析檢測后，發現NC組和HC組大多數外泌體的粒徑集中在(70±5)nm，HC組粒徑為70 nm的外泌體數量明顯多于NC組，HC組外泌體粒徑大小范圍與NC組外泌體粒徑大小范圍都在30～150 nm，見圖2。對血清外泌體濃度分析時，發現NC組血清外泌體濃度約為1.0×1010個/mL，HC組約為5.5×1010個/mL，見圖3?？梢妴挝惑w積HC組血清外泌體濃度極顯著大于NC組(P<0.01)。

圖2 血清外泌體富集組分的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of serum exosome enriched components

圖3 血清外泌體的濃度Fig.3 Concentration of serum exosomes與NC組比較，**：P<0.01Compare with NC group,**：P<0.01

2.3 miRNA表達譜分析及差異表達譜分析 對兩組樣品miRNA表達譜分析，有287個miRNA在兩組樣品中均有表達，18個miRNA在NC組中特異表達，39個miRNA在HC組中特異表達，見封二圖4。在兩組樣品中共有的miRNA差異表達分析，表達差異極其顯著(P<0.01)的數目為83個，其中HC組較NC組有51個miRNA上調表達、32個miRNA下調表達，見封二圖5。上調表達的前5個miRNA：gga-miR-214、gga-miR-1434-3p、gga-miR-1416-5p、gga-miR-1416-5p和gga-miR-29b-2-5p，下調表達的前5個miRNA： gga-miR-6544-5p、gga-miR-19a-3p、gga-miR-6582-3p、gga-miR-142-3p和gga-miR-122-5p，其對應的靶基因主要參與氧化磷酸化、蛋白質轉運、絲氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝。見表2。

圖4 常溫對照組和高溫控制組miRNA測序數據的韋恩圖Fig.4 Venn diagrams of miRNA sequencing data in NC group and HC group

圖5 高溫控制組對比常溫對照組間miRNA差異表達Fig.5 Differential expression of miRNA of HC group compared with NC group

表2 部分差異表達miRNA列表Table 2 List of partial differentially expressed miRNA

2.4 差異表達miRNA靶基因功能預測與分析 對兩組樣品差異表達miRNA靶基因功能進行預測與分析，在GO數據庫中可極顯著(P<0.01)富集的生物學過程群(Biological process，BP)有信號轉導、氧化還原過程、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的正調控、轉錄調控DNA模板、G蛋白偶聯受體信號通路、蛋白質磷酸化、蛋白質水解、轉錄陽性調控DNA模板、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的負調控、細胞內蛋白質轉運、跨膜轉運、磷酸化、蛋白質泛素化、RNA聚合酶Ⅱ對轉錄的調控、細胞增殖的正向調節、凋亡過程的負調控、基因表達的正調控、轉錄負調控DNA模板、細胞內信號轉導、蛋白質轉運、離子輸運、信號受體活性調控、翻譯、囊泡介導的轉運、細胞增殖負調控，細胞組分群(Cellular component，CC)有細胞膜、細胞膜組成成分、細胞質、細胞核、胞質、質膜、核質、線粒體、細胞外間隙、內質網、高爾基體、胞外區、質膜整體組分、細胞內膜結合細胞器、核仁，分子功能群(Molecular function，MF)有蛋白質結合、金屬離子結合、ATP結合、核苷酸結合、DNA結合、轉移酶活性、相同蛋白結合、水解酶活性、蛋白質同聚活性、核酸結合，見封二圖6；在KEGG數據庫中極顯著(P<0.01)富集的通路有泛素介導的蛋白質水解、泛醌等萜類醌生物合成、酪氨酸代謝、蛋白質輸出、吞噬體、P53信號通路、氧化磷酸化、鞘糖脂生物合成、葉酸生物合成、鐵死亡、脂肪酸降解、內吞作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、心肌收縮、丁酸代謝、生物素代謝、自噬動物、細胞凋亡、Apelin信號通路、脂肪細胞因子信號通路。見封二圖7。

圖6 差異表達外泌體miRNA靶基因GO功能聚類分析Fig.6 Gene ontology classifications of target genes of differentially loaded miRNA analyzed in exosomes

圖7 差異表達外泌體miRNA靶基因KEGG通道聚類分析Fig.7 Kyoto encyclopedia of genes and genomes classifications of target genes of differentially loaded miRNA analyzed in exosomes

2.5 差異表達miRNA的定量PCR檢測 挑選測序結果中顯著差異表達的9個miRNA進行定量檢測驗證，分別是HC組4個miRNA表達上調的gga-miR-221-3p、gga-miR-30a-5p、gga-miR-199-5p和gga-miR-214，HC組5個miRNA表達下調的gga-miR-122-5p、gga-miR-100-5p、gga-miR-125b-5p、gga-miR-142-3p和gga-miR-19b-3p，見圖8A。結果表明，4個miRNA上調表達，其中表達差異極顯著(P<0.01)有3個(gga-miR-221-3p、gga-miR-30a-5p和gga-miR-214),表達差異顯著(P<0.05)有1個(gga-miR-199-5p)；5個miRNA下調表達，其中表達差異極顯著(P<0.01)有3個(gga-miR-122-5p、gga-miR-142-3p、gga-miR-19b-3p)，表達差異顯著(P<0.05) 有2個(gga-miR-100-5p和gga-miR-125b-5p)，見圖8B。結果顯示，定量PCR表達差異趨勢與miRNA測序結果一致。

圖8 差異表達miRNA的定量PCR檢測Fig.8 Detection of differentially expressed miRNA by quantitative PCRA：測序數據分析結果； B：定量PCR檢測結果與NC組比較，*：P<0.05, **：P<0.01A:Results of sequencing data analysis; B:Results of qRT-PCR detectionCompare with NC group,*:P<0.05, **:P<0.01

3 討論

熱應激作為最常見的應激因素之一，通過使蛋白質變性進而影響細胞活性及功能，通常體現為蛋雞生長發育、自身免疫功能、產蛋量及產蛋品質受到影響，對廣大蛋雞養殖產業產生了巨大的影響。血液中存在外泌體，其內涵物會隨著機體功能的改變而發生變化，當機體處于熱應激狀態時，外泌體miRNA的表達也會出現改變。有研究表明，當機體受到應激作用時，會通過不同的途徑促進外泌體的釋放。大鼠腎近端腎小管細胞處于缺氧狀態時，可以顯著促進機體細胞產生和分泌外泌體，而這些缺氧狀態下產生的外泌體對于大鼠腎小管細胞的損傷具有保護作用[9]。同時，也有研究發現，低氧誘導因子1可以誘導處于缺氧狀態的腎小管上皮細胞產生外泌體，通過調節外泌體的含量來調控受體細胞的生理功能[10-11]。祝鑫桃對熱應激肝細胞外泌體蛋白質譜分析及其促進程序性死亡作用初探的研究表明，經熱應激處理的肝細胞可以產生釋放大量的外泌體，引起肝損傷[12]。在本試驗中，對外泌體形態及粒徑大小分析的結果與上述研究結果相似，形態結構符合外泌體的形態描述，外泌體粒徑大小在30～150 nm，說明本試驗分離出血清外泌體。對兩組樣本進行外泌體濃度的測定，發現HC組的血清外泌體濃度(5.5×1010個/mL)大于NC組外泌體濃度(1.0×1010個/mL)，說明當機體受到熱應激時，會促進外泌體的產生和分泌。

當動物機體受到熱應激時，機體的各項生理生化指標都會發生改變，如：免疫指標、抗氧化指標、蛋白質、酶和激素等，從而使機體的免疫功能和抗氧化功能減弱。有研究表明，miRNA對處于熱應激動物的細胞增殖、分化、凋亡、免疫功能、抗氧化功能及繁殖性能有重要的調節作用[13]。趙健等闡明NGR 1對動脈粥樣硬化的作用的研究中，經過雙熒光素酶報告試驗證實miR-221-3p是HUVECs中XIST的靶點，miR-221-3p與TRAF 6相互作用，NGR1通過核因子Kappa B(NF-κB)途徑調節ox-LDL作用于內皮細胞的增殖、凋亡、炎癥反應和氧化應激[14]。傅曉東等證明，miR-30a-5p的表達上調可抑制MAPK/ERK信號從而抑制炎癥反應，同時增加SEPN1、TXNL1和GPX1的表達，增強了氧自由基的清除作用，抑制氧化應激[15]。王艷等對miR-214靶向抑制CaMKⅡ調節缺氧復氧誘導H9c2心肌細胞氧化應激的作用的研究中，過度表達的miR-214可抑制CaMKⅡ轉錄后翻譯過程，從而改善H9c2心肌細胞氧化應激水平及凋亡狀態[16]。Antonini等研究表明，miR-34a、miR-34b可通過調控凋亡基因(p53)的表達來調控DNA損傷修復、細胞周期阻滯、細胞凋亡[17]。本試驗通過對蛋雞血清外泌體miRNA進行高通量測序以及利用qRT-PCR技術檢測驗證，發現高溫控制組相比于常溫對照組，血清中外泌體miRNA 共有83個差異表達，根據上述已發現的研究，說明了本試驗中差異表達的miRNA在熱應激狀態下，受到了激活或抑制，使miRNA表達量上調或下調，對細胞增殖、分化、凋亡、免疫功能有調節作用，產生了一系列抗熱應激的生理過程，使蛋雞適應熱應激對機體所產生的影響。

當對兩組樣品中差異表達miRNA靶基因功能分析時，發現在GO數據庫中可極顯著富集的生物學過程群有信號轉導、氧化還原過程、G蛋白偶聯受體信號通路、蛋白質磷酸化、蛋白質水解、磷酸化、蛋白質泛素化、凋亡過程的負調控、信號受體活性調控、翻譯、囊泡介導的轉運、細胞增殖負調控等；在KEGG數據庫中可以顯著富集的通路有泛素介導的蛋白質水解、吞噬體、P53信號通路、氧化磷酸化、葉酸生物合成、鐵死亡、脂肪酸降解、內吞作用、自噬、細胞凋亡、Apelin信號通路、脂肪細胞因子信號通路。高溫環境造成的熱應激會引起動物的氧化應激，氧化還原的穩態受到了破壞，使活性氧自由基(ROS)產生過量，導致機體的抗氧化能力下降。與此同時，熱應激使活性氧自由基(ROS)過量產生激活了細胞凋亡的內源性途徑(即線粒體外膜細胞色素C釋放的線粒體途徑)，當細胞色素C進入細胞質后，激活了起始因子和效應器凋亡蛋白(即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)，使細胞程序性死亡，這證實了熱應激能誘導細胞壞死[18]。氧化磷酸化是ATP產生的途徑之一，有研究表明，熱應激會影響氧化磷酸化過程中的酶活性，從而影響機體對碳水化合物的代謝，葡萄糖是動物主要的功能物質，處于熱應激狀態的動物血糖水平較正常動物有所下降，處于負能量狀態，不能滿足動物生長需要[19]，熱應激會減少脂肪的分解，降低脂肪分解酶的活性，降低游離脂肪酸的水平[20]。有研究表明，熱應激能影響細胞膜的流動性和穩定性，從而抑制了細胞內蛋白質運輸和蛋白質轉運。上述說明熱應激動物在熱應激與抗熱應激過程中，涉及氧化還原過程、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸降解、細胞內蛋白質運輸、蛋白質轉運、蛋白質輸出、細胞凋亡等生物學過程，本試驗所檢測到信息與報道基本一致。

綜上所述，熱應激會使機體各項生理生化指標發生改變，血清外泌體濃度增加，83個血清外泌體miRNA差異表達，從而使機體的免疫功能和抗氧化功能減弱，且與熱應激與抗熱應激密切相關的調控通路有氧化還原過程、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸降解、細胞內蛋白質運輸、蛋白質轉運、蛋白質輸出、細胞凋亡。本試驗的外泌體測序數據為研究熱應激對蛋雞生產性能的影響提供了基礎數據，也為外泌體在蛋雞熱應激及抗熱應激的研究提供了參考。